極微量重差分化法の開発と応用

2007 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15101006
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 野島 博 Osaka University, 微生物病研究所, 教授 (30156195)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藪田 紀一 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (10343245) ; 奥崎 大介 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (00346131)
• Keywords: Chum-RNA / cDNAライブラリー / 極微量 / 多段差引法 / リン酸化 / 中心体 / 細胞周期 / 癌

Research Abstract

極微量重差分化法の基盤となる技術の開発に成功し特許も申請した。この技術においてはチャムRNA(Chum-RNA)、別名ダミーRNA、と命名した独自の小さなRNA分子が中心となる。具体的にはチャムRNAを反応液に加えるだけで酵素のKm値を上昇させることができるため、極微量のサンプルから調製したmRNAを用いても逆転写酵素やDNAリガーゼなどを働かせる事ができた。実際、一個のヒト培養細胞(HeLa)相当分の全RNAを用いた場合でさえ、以後の酵素反応に十分な量のmRNAが、PCRを全く使うことなくT7RNAポリメラーゼを用いるだけで増幅できた。この確認はGAPDHのcDNAを検出する事で行った。一方、試験管内で生合成したGAPDH mRNAを用いた場合には、0.49フェムトグラム(730mRNA分子数に相当する)という、極微量のmRNAを用いたときにさえ逆転写反応が開始した。T7RNAポリメラーゼによる増幅の利点は、多様なmRNA分子種が偏在無く増幅される事だが、実際、このようにして一個の細胞由来のRNA(チャムRNA付加),あるいは約100万個の細胞由来のRNA、を用いて増幅したmRNAをバイオアナライザーにかけてサイズ分布を比較したところ、ほとんど差異のない分布図が得られた。この実験により、一回の増幅プロトコールにより、約30倍の増幅が進んでいることが分かった。この手法を基盤にして、一個の細胞由来のRNAを用いて、PCRを全く使うことなく高品質のcDNAライブラリーを作製するプロトコールを開発し、4回増幅後に66万個の独立cDNAクローンを持つcDNAライブラリーを作成した。その品質を約100万個の細胞由来のRNA、を用いて作成したcDNAライブラリーとマイクロアレイを用いて比較したところ両者同等に高品質であった。この他、当該研究テーマに関する多くの応用研究を進めた。

Research Products

• [Journal Article] PRDM14 suppresses expression of differentiation marker genes in human embryonic stem cells. (2008)
  • Author(s): Tsuneyoshi N, Sumi T, Onda H, Nojima H, Nakatsuji N, Suemori H.
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Res. Commun. 367(4) Pages: 899-905
  • Description: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Overexpression of connexin 26 in carcinoma of the pancreas. (2008)
  • Author(s): Kyo N, Yamamoto H, Takeda Y, Ezumi K, Ngan CY, Terayama M, Miyake M, Takemasa I, Ikeda M, Doki Y, Dono K, Sekimoto M, Nojima H, Monden M.
  • Journal Title: Oncol Rep. 19(3) Pages: 627-631
  • Description: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Focused microarray analysis of peripheral mononuclear blood cells from Churg-Strauss syndrome patients. (2008)
  • Author(s): Tougan T, Onda H, Okuzaki D, Nojima H.
  • Journal Title: DNA Res. 15(in press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The fission yeast Mug27/Ppk35, a mammalian Lats2 homologue, is a meiosis-specific protein kinase that functions in meiosis II and sporulation. (2008)
  • Author(s): Ohtaka A, Saito TT, Okuzaki D, Kobayashi S, Hashimoto H, Nojima H.
  • Journal Title: J. Cell Sci. 121(in press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mcp4, a meiotic coiled-coil protein, plays a role in F-actin positioning during Schizosaccharomyces pombe. (2007)
  • Author(s): Ohtaka, A., Okuzaki D, Nojima H.
  • Journal Title: Eukaryot Cell 6(6) Pages: 971-983
  • Description: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Lats2 is an essential mitotic regulator required for the coordination of cell division. (2007)
  • Author(s): Yabuta, N., Okada, N., Ito, A., Hosomi, T., Nishihara, S., Sasayama, Y., Fujimori, A., Okuzaki, D., Zhao, H., Ikawa, M., Okabe, M. Nojima, H.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. 282(26) Pages: 19259-19271
  • Description: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Synthesis of N-functional oleamide derivatives. (2007)
  • Author(s): Ohba Y, Kanao Y, Takatsuji M, Ito M, Yabuta N, Nojima H, Kita Y.
  • Journal Title: Tetrahedron 63(18) Pages: 3754-3761
  • Description: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Oleamide derivatives are prototypical anti-metastasis drugs that act by inhibiting connexin 26 (2007)
  • Author(s): Nojima H, Ohba Y, Kita Y.
  • Journal Title: Curr. Drug Safety 2 Pages: 204-211
  • Description: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Aberrant expression of connexin 26 is associated with lung metastasis of colorectal cancer. (2007)
  • Author(s): Ezumi K, Yamamoto H, Murata K, Higashiyama M, Damdinsuren B, Nakamura Y, Okami J, Takemasa I, Ikeda M, Sekimoto M, Matsuura N, Nojima H, Monden M.
  • Journal Title: Clin. Cancer Res. 14(3) Pages: 677-684
  • Description: 「研究成果報告書概要(和文)」より
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Oleamide derivatives suppress the spontaneous metastasis by inhibiting connexin 26. (2007)
  • Author(s): Ohba Y, Kanao Y, Morita N, Fujii E, Hohrai M, Takatsuji M, Hirose H, Miura D, Watari A, Yutsudo M, Zhao H, Yabuta N, Ito A, Kita Y, Nojima H.
  • Journal Title: Int J Cancer 121(1) Pages: 47-54
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Camellia oil and its distillate fractions effectively inhibit the spontaneous metastasis of mouse melanoma BL6 cells. (2007)
  • Author(s): Miura D, Kida Y, Nojima H.
  • Journal Title: FEBS Lett. 581(13) Pages: 2541-2548
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A role for connexin 26 in metastasis of human malignant melanoma: communication between melanoma and endothelial cells via connexin 26. (2007)
  • Author(s): Saito-Katsuragi M, Asada, H, Kitamura K, Niizeki H, Katoh F, Masuzawa M, Tsutsumi M, Kuniyasu H, Ito A, Nojima H, Miyagawa S.
  • Journal Title: Cancer 110(5) Pages: 1162-1172
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Meiosis specific coiled-coil proteins in Shizosaccharomyces pombe. (2007)
  • Author(s): Ohtaka A, Saito, T.T. Okuzaki D, Nojima H.
  • Journal Title: Cell Div. 2 Pages: 14-21
  • Peer Reviewed
• [Remarks]
  • URL: http://www.biken.osaka-u.ac.jp/act/act_nojima.php