2004 Fiscal Year Annual Research Report
PASドメインをもつ転写因子間相互作用の細胞内リアルタイム観測
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15207010
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
十川 和博 東北大学, 大学院・生命科学研究科, 教授 (80175421)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福村 裕史 東北大学, 大学院・理学研究科, 教授 (50208980)
安元 研一 東北大学, 大学院・生命科学研究科, 助教授 (90241629)
菊池 康夫 東北大学, 大学院・生命科学研究科, 助教授 (10004467)
高崎 親久 東北大学, 大学院・生命科学研究科, 助手 (10004491)
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| Keywords | FRIM-FRET / CFP / YFP / Living cell / protein-protein interaction / transcription factor |
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| Research Abstract |
単一光子計測が可能な検出器を組み添んだ顕微鏡システムが完成した。CFPとYFP由来のcitrineをそれぞれ培養細胞であるCHO-K1細胞で発現し、その蛍光寿命を測定したところ、3.3nsと3.2nsであった。これらの数値は文献値とよく一致していた。続いて、N末端側にcitrineをC末端側にCFPを18アミノ酸のペプチドでつないだキメラタンパク質をCHO-K1細胞で発現した。CFPの蛍光寿命が2.5nsにcitrineの蛍光寿命が3.0nsとなった。また、citrineの蛍光観測で強い蛍光のライズが計測できた。これらの結果は、このキメラタンパク質のCFPとcitrineの間で分子内FRETが起きていることを示している。また、このキメラタンパク質のN末端に核移行シグナルをつけ、核内でのFLIM-FRET計測を行った。その結果、細胞質でのFRETの結果と大部分は同じ蛍光寿命をもつ成分が観測されたが、一部異なった成分も観測された。現在、この原因について調べている。
解糖の第6反応と第7反応を触媒するGAPDHとPGKは複合体を形成していることが示唆されているが、生細胞で直接調べた報告はない。そこで、CFP由来のcereleanとPGKとのキメラタンパク質とcitrine-GAPDHをCHO-K1細胞で発現し、分子間FRETを観察した。現在のところ、プレリミナリーな結果であるが、ceruleanの蛍光寿命の短縮と、citrineの蛍光のライズが観測され、単一生細胞でこの2つの酵素が複合体を形成していることが観察できた。
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