マウス虚血モデルを用いた遅発性カルシウム上昇メカニズムの解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15300131
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 芝崎 太 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 副参事研究員 (90300954)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹縄 忠臣 東京大学, 医科学研究所・癌・細胞増殖大部門・腫瘍分子医学研究部, 教授 (40101315) ; 内野 博之 東京医科大学, 八王子医療センター・麻酔科, 講師 (60266476) ; 加藤 裕之 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (30301732)
• Keywords: カルシニューリン / 遅発性神経細胞死 / 虚血 / カルシウム受容体 / 遺伝子解析 / 免疫抑制剤 / サイクロスポリンA / FK506

Research Abstract

1.カルシニューリンにより制御される虚血関連因子の総合的な解析
カルシニューリン活性を介して遅発性神経細胞死を惹起する新たな因子を網羅的に解析するため、カルシニューリンの阻害剤であるCsA投与、非投与群の虚血ラットのCA1からmRNAを抽出し、ラット用DNAチップ(アジレント製、15,000種類以上)にて解析した。虚血後1、6、12、24,48時間後には全体で約3,000遺伝子の変化が認められた。さらにCsAの投与により、上昇または低下する遺伝子が約800遺伝子同定された。これらの中で、条件を絞ることによって、この1/10の遺伝子、約100個が有意に変化していることが想定されたため、現在RT-PCR等を用いて、その確認を急いでいる。
2.カルシニューリン活性により制御されるカルシウム受容体の機能解析
海馬のスライスを用いたin vitroの実験系において、CsAおよびFK506の投与により、低酸素刺激による細胞内カルシウム上昇がきわめて効果的に抑制できることが判明した。この結果は、カルシニューリンが、カルシウム受容体(細胞膜、または細胞内)を制御していることを示している。現在、カルシニューリンの特異的阻害蛋白であるCabinを用いたアデノウイルスベクター、およびCsAの別のターゲットであるcyclophilin Dのdominant negative変異体を用いたアデノウイルスベクターを作製した。今後、これらの発現ベクターを用いて、海馬スライスにて効果を観察する。
3.Phospholipase Cδ1(PLCδ1)マウスを用いた前脳虚血におけるPLCδ1の役割解析
虚血初期および後期の細胞内カルシウム調節の重要な因子としてPhospholipase Cがあり、神経細胞では特にそのサブタイプであるPLCd1がin vitroの実験系において細胞死に直接関与していることが判明している。ただ、今年になって、作製されたPLCd1マウスに関しては、日本の他のグループから、虚血による変化がないとの報告があり、この系の評価をやめ、来年度はNCX2のKOマウスを用いて解析を進める予定である。

Research Products

• [Publications] Tomida T, Hirose K, Takizawa A, Shibasaki F, Iino M: "NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2^+ oscillation"EMBO J.. 22. 3825-3832 (2003)
• [Publications] 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫: "「脳を守るための戦略」虚血性神経細胞死の分子機序と薬物療法による脳保護の可能性について"Lisa. 11. 114-117 (2004)
• [Publications] 芝崎 太, 内田和代: "新規同時他項目アッセイシステムeTagの応用"バイオベンチャー. 18. 38-40 (2004)
• [Publications] 芝崎 太, 内野博之: "特集「病態とアポとーシス」虚血による神経細胞死とカルシウム・カルシニューリン"Biotherapy. 18. 23-26 (2004)
• [Publications] 内野博之, 芝崎 太, 石井脩夫: "虚血性神経細胞死におけるカルシニューリンの役割"臨床検査(医学書院). 12-18 (2003)