2003 Fiscal Year Annual Research Report
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15370025
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
杉浦 昌弘 名古屋市立大学, 大学院・システム自然科学研究科, 教授 (80027044)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小保方 潤一 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (50185667)
櫻井 宣彦 名古屋市立大学, 大学院・システム自然科学研究科, 講師 (00255233)
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| Keywords | 葉緑体 / タバコ / トランス因子 / RNAエディティング / in vitro系 / mRNA / 部位認識 / 非アイソトープ法 |
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| Research Abstract |
高等植物葉緑体の転写産物は、CからUへのRNAエディティングにより配列の一部が変換する。この反応はmRNA中のシチジン残基の1000個に1個を正確に部位認識する必要がある。
1.葉緑体調製法の改良
我々が開発したin vitroRNAエディティング系を用いてpsbE mRNAエディティングのトランス因子が56kDaタンパク質であることを同定した。この因子を大量に調製するために、タバコより大量の葉緑体調製法の改良を行った。シヨ糖ステップグレジェント遠心法で安価で短時間で調製可能となった。無傷葉緑体の検定にはドイツの研究者の助言が有効であった。
2.「in vitro RNAエディティング系」の改良
以前に開発した「in vitro RNAエディティング系」はP32標識mRNA基質を用いるため煩雑であった。そこで、簡素化のため非アイソトープ法として、蛍光標識ダイデオキシヌクレオチドとプライマー伸長法を組み合わせた新しい活性測定法の開発に成功した。この手法ではP32標識基質の作製が困難なmRNAにも対応可能である。
3.エディティングの部位認識因子の単離
既に、4種のエディティング部位のトランス因子を同定したが、そのうちでin vitro活性の最も高いpsbE mRNAエディティングに対する56kDaのトランス因子の単離を進めた。タバコ緑葉10kg相当より葉緑体を単離し、硫安分画法とゲル濾過法でin vitroエディティング活性を指標に精製を行いほぼ単一のタンパク質を得た。
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[Publications] Sugiura, M.: "History of chloroplast genomics"Photosynthesis Research. 76. 371-377 (2003)
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[Publications] Hasegawa, K.: "A tRNA^<Lew>-like sequence located immediately upstream of an Arabidopsis clock-regulated gene is transcriptionally active"Gene. 307. 133-139 (2003)
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[Publications] Nakamura, T.: "Array-based analysis on tobacco plastid transcripts : preparation of a genomic microarray containing all genes and al intergenic regions"Plant Cell Physiology. 44. 861-867 (2003)
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[Publications] Cloix, C.: "In vitro analysis of sequences required for transcription of the Arabidopsis thaliana 5S rRNA genes"Plant Journal. 35. 251-261 (2003)
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[Publications] Miyamoto, T.: "A site-specific factor interacts directly with its cognate RNA editing site in chloroplast transcripts"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 101. 48-52 (2004)
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[Publications] Hirose, T.: "Functional Shine-Dalgarno-like sequences for translational initiation of chloroplast mRNAs"Plant Cell Physiology. 45. 114-117 (2004)
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[Publications] Yukawa, Y.: "In vitro transcription system from BY-2 cells. In "Biotechnology in Agriculture and Forestry", vol."BY-2 Cells""Springer. (2003)
