2004 Fiscal Year Annual Research Report
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15370025
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
杉浦 昌弘 名古屋市立大学, 大学院・システム自然科学研究科, 教授 (80027044)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
櫻井 宣彦 名古屋市立大学, 大学院・システム自然科学研究科, 講師 (00255233)
小保方 潤一 名古屋大学, 遺伝子実験施設, 助教授 (50185667)
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| Keywords | RNAエディティング / mRNA / in vitro / シス配列 / トランス因子 / 蛍光標識 |
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| Research Abstract |
1)in virto RNAエディティング系の改良
従来のin vitro系では、RI標識したmRNA基質を用いるため、基質の調製法が煩雑で短期間しか使用できなかった。一昨年度、系の簡素化のため、蛍光標識ダイデオキシヌクレオチドとプライマー伸長法を組み合わせた新しい非RI法の確立を試み開発に成功したので、さらに高感度化を行った。次いで、この系を用いて、タバコ葉緑体の光化学系成分のNADH脱水素酵素サブユニットをコードするmRNAのエディティング部位についてin vitroエディティング効率を測定した。その結果、ndh-2の30%という高い効率から活性のほとんど検出できないものまであった。このうちndh-2とndhFのエディティングのシス配列を変異mRNA群を調製して分析し、ndh-2 mRNAでは10〜6ヌクレオチドの1ヶ所、ndhF mRNAでは40〜36と15〜6ヌクレオチドの2ヶ所がシス配列と同定した。シス配列が2ヶ所に分かれるのは初めての例で、エディティング機構の新しいモデルを考察した。
2)エディティング部位の認識因子の単離
昨年度に引き続き、in vitro活性の最も高いタバコ葉緑体psbE mRNAエディティングに対する56kDaのトランス因子について12kgのタバコ葉より大量のタンパク質を調製し、硫安分画、ヘパリンカラム、ゲルろ過法などを組み合わせて単離した。ゲル電動泳動で56kDa相当のバンドを切り出し、MS/MS法で部分アミノ酸配列を決定した。BLAST探索で対応する配列がデータベース内に見出せなかったので、タバコ固有のタンパク質と考えられる。
3)部位認識因子の同定
既に4種のトランス因子を同定したが、更にタバコ葉緑体ndhFとrpoBのmRNAエディティングのトランス因子をUVクロスリンク法で同定した。ゲル電気泳動で各々82kDaと60kDaであることが示された。
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