2004 Fiscal Year Annual Research Report
改変PEPC遺伝子導入植物の作出を目指したC4光合成酵素の構造生物学
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15370045
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
甲斐 泰 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (40029236)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 豪 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (20263204)
金久 展子 大阪大学, 大学院・工学研究科, 講師 (20177538)
松村 浩由 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (30324809)
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| Keywords | C4植物 / ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ / 活性調節メカニズム / 構造-機能相関 / NADP依存型リンゴ酸酵素 / PEPC-PK / PEPC変異体K620S |
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| Research Abstract |
本研究では、C4植物に特徴的な酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)のin vitro活性調節機構を解明することを目的として、PEPCに元来備わっている活性調節の分子機構解明に加えて、PEPCの活性調節に関与する同じ代謝系の酵素群の機能を構造科学的に解明することを目的とした。
まず、アロステリック阻害剤であるリンゴ酸に阻害を受けない大腸菌由来酵素変異体K620Sの立体構造解明を目的として、酵素を大量発現し結晶化を行った。その後、放射光施設SPring-8にて回折強度データ収集を行い、3.0Å分解能までのデータを収集した。続いて、分子置換法により構造解析を行い、アロステリック阻害剤脱感作の分子機構を明らかにした。現在、論文執筆中である。
次に、PEPCの活性調節に重要な役割を担っているPEPCに特異的なリン酸化酵素(PEPC-PK)の立体構造解明を目的とし、本酵素の大量発現・精製・結晶化を行った。微結晶は得られたものの残念ながらX線構造解析に適した単結晶が現在のところ得られなかった。
続いて、PEPCの阻害剤であるリンゴ酸を基質とするNADP依存型リンゴ酸酵素(NADP-ME)の構造-機能相関解明を目的とし、本酵素の大量発現・精製・結晶化を行った。単結晶を得ることが非常に困難であったが、SPring-8にて3.0Å分解能の回折強度データを収集することに成功した。現在、更なる結晶化条件の検索と立体構造解析を行っている。
更に、本研究では、立体構造情報を元に生化学者と共同でPEPC変異体を作成し、詳細なPEPC活性調節メカニズムにおける構造-機能相関を解明した。これらの成果に加えて、本研究では数種類のタンパク質を扱い結晶化を行う過程で、溶液状態制御による新しい結晶化手法を考案し、これら新規手法が良質のタンパク質結晶成長に有効であることを明らかにした。
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