2004 Fiscal Year Annual Research Report
細胞の塩環境適応と膜イオン輸送蛋白質の機能制御の分子的基盤
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15370054
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
金澤 浩 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (50116448)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福山 恵一 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (80032283)
中村 徳弘 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (90324748)
三井 慶治 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助手 (60379279)
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| Keywords | 細胞の塩環境適応 / Na^+ / H^+交換輸送蛋白質 / 遺伝子解析 / イオン輸送の分子機構 / 能動透過系のエネルギー共役 / 遺伝子工学 / FRET解析 / Cys走査変異解析 |
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| Research Abstract |
細胞の中でH^+,Na^+,k^+,Ca^<2+>などの重要なイオンに関する環境は一定に保たれており、その調節は,細胞膜や細胞内小胞などの生体膜に存在するイオン輸送性の膜蛋白質によって行われている。特にNa^+は、細胞内部では低く保たれ、細胞外では高い。本研究では、このNa^+勾配を利用しpH制御に関わったり、Na^+自身の制御、すなわち細胞や個体の耐塩性に中心的役割を果たすNa^+/H^+交換輸送蛋白質(NhaA, Nhalp, NHEと省略)の構造と機能、制御について研究を行った。本年度の成果として、真正細菌に広く存在する交換輸送蛋白質NhaAについてイオン輸送に関わる膜中ドメイン(TM)4,5,10,11について、それぞれを構成するアミノ残基をシステインに置換し、機能の変換およびNEMの結合を指標にそれぞれの残基の機能と空間配置を考察した。この結果、NhaAの中に水で満たされたchannel構造が4つのTmで形成されること、またイオン結合に関与する残基の配置が推定された。さらにNhaAのカルボキシ末端に蛍光蛋白GFPの誘導体を結合し、細胞膜内でNhaAが2量体を形成していること、2量体の形成サブユニットはイオン輸送においてLi^+の結合にともなって相互の位置関係の変化(構造変化)をすることが明らかになった。酵母のNhalpのイオン輸送活性を直接測定する実験系を酵母内の輸送膜小胞にNhalpを蓄積させることによって実現した。その結果、Nhalpは一価のメタル陽イオン全般について輸送能を有すること、またそのイオンに対する見かけの親和性は低いことが明らかになった。Nhalpは、2量体を形成すること、2量体は粗面小胞体ですでに形成されていることも明らかになった。Nhalpに結合し耐塩力の増強に関与する新規因子については、アイソフォームの遺伝子を欠失させ、それらの機能の解析を行った。ヒトの細胞に存在する4つのNHEについては、細胞内の異なる小胞に存在し、小胞内のpH制御に関わることを明らかにした。
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