核膜孔複合体通過機構:蛍光1分子観察で得られた通過モデルの分子的証明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15370090
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 今本 尚子 独立行政法人理化学研究所, 細胞核機能研究室, 主任研究員 (20202145)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 谷口 直子 大阪大学, 大学院・生命機能研究科・神経可塑性生理学研究室, 特任教員(COE) (90360586) ; 小瀬 真吾 独立行政法人理化学研究所, 細胞核機能研究室, 研究員 (90333278)
• Keywords: 核-細胞質間輸送 / 核膜孔複合体 / 核膜孔複合体構成因子 / importin β / 輸送担体

Research Abstract

1分子可視化技術を利用して輸送担体importinβと核膜孔複合体の相互作用を調べたところ、核膜孔複合体にはimportinβに対するおよそ70nM程度のアフィニティーを示す100〜200の結合サイトと、サブピコモルオーダーの8〜16の非常に強い結合サイトが存在することが明らかになった。GFP標識したimportinβや基質が孔を通過する際の核膜孔上の滞在時間から、核膜孔を通過するimportinβ単体は強い結合サイトへ結合すると考えられる。それに対し、基質/importinβ複合体は孔を通過しないRan非存在の条件下では、弱い結合サイトへの結合は認められるものの、強い結合サイトへの結合が認められなかった。しかし、Ranが存在すると、基質/importinβ複合体はimportinβ単体で見られた滞在時間よりも短いものの、弱い結合サイト以外の結合サイトへの結合が見られ、そのサイトへ結合することが通過反応に必須であることが通過速度の解析から示唆された。通過反応に必須と考えられるそのサイトと、importinβに対する強い結合サイトが深く関連する可能性が高い。importinβに対する強い結合サイトがimportinβ輸送経路の通過反応に重要であることを示すため、現在、importinβと最も強い結合定数を示す核膜孔複合体構成因子欠損細胞の作製をRNAi法を利用して進めており、欠損細胞を用いてimportinβ輸送経路の活性を調べようとしている。また、importinβの結晶構造を指標に、通過反応に支障を来たす複数のimportinβ点変異体の作製に成功している。現在、野生型importinβとその変異体との間に、結合する核膜孔複合体構成因子の種類とアフィニティーにどのような違いがあるのかを、光化学架橋法と単離した核膜孔複合体構成因子の両方を用いて調べている。

Research Products

• [Publications] Soo Jae Lee: "The accommodation of asymmetric dimmer transcription factor by importin β"Science. 302. 1571-1575 (2003)
• [Publications] Maiko Furuta: "Heat-shock induced nuclear retention and recycling inhibition of importin α"Genes Cells. in press. (2004)
• [Publications] 今本 尚子: "核-細胞質間輸送の分子機構と輸送経路の多様性"実験医学. Vol.21No.14. 1842-1849 (2003)
• [Publications] 今本 尚子: "細胞内輸送研究-細胞と個体形成の秩序を知る"実験医学. Vol.21No.14. 1836-1841 (2003)
• [Publications] 小瀬 真吾: "核膜孔複合体と核-細胞質間輸送"蛋白質核酸酵素. 印刷中. (2004)
• [Publications] 今本 尚子: "核膜孔複合体の分子構築とダイナミクス"シュプリンガー・フェアラーク東京株式会社(印刷中). (2004)