昆虫体内への外来タンパク輸送システムの構築

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15380043
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyoto Institute of Technology
• Principal Investigator: 杉村 順夫 京都工芸繊維大学, 工芸科学研究科, 教授 (20273542)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北島 佐紀人 京都工芸繊維大学, 工芸科学研究科, 助手 (70283653) ; 長岡 純治 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 助手 (00303933) ; 古澤 壽治 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 教授 (70127166) ; 平山 力 独立法人農業生物資源研究所, 主任研究員 (90370676)
• Keywords: ウレアーゼ遺伝子 / タンパクの体内取り込み / クワ / カイコ / トランスポーター

Research Abstract

1.トランスポーター能力の評価系の構築
クワ蛋白を人工飼料と共に摂食投与する方法では、カイコ個体間で摂食量が不均一となり、定量的な投与が困難であった。この欠点を克服するため、供試蛋白液を強制的に口唇から注入する投与法を確立した。
2.ウレアーゼの精製と遺伝子クローニング
(1)クワウレアーゼの精製
クワ葉に含まれる多量の多糖類を除去するために、アセトン及び硫安による分画抽出が有効であることを確認した。ゲル濾過、イオン交換クロマト及びアフィニティークロマトによる精製を検討する予定である。
(2)クワウレアーゼ遺伝子のクローニングと発現
精製クワウレアーゼタンパク質のN末端アミノ酸配列と他の植物で単離されたウレアーゼ遺伝子配列をもとに、プライマーを合成した。このプライマーを用いて、クワ葉から調製したmRNAをもとに、RT-PCRを行なった。その結果、完全長と考えられる2種類のクワウレアーゼcDNA(2511,2311 bp)をクローニングした。単離された遺伝子は他の植物から単離されたウレアーゼ遺伝子と全領域で高い相同性が確認できた。さらに、これら2種類の遺伝子から大腸菌のタンパク質発現系を利用してタンパク質を得ることができた。今後、この発現タンパク質を用いて、クワウレアーゼのトランスポーター機能部位の同定を行なう。
3.新規なトランスポーターの探索
投与したウレアーゼは中腸の消化液で分解や修飾を受けずに、体内に取り込まれることを確認した。即ち、Native電気泳動後のゲル内活性染色、In vitro活性測定、ウエスタンブロッテイングの実験から、活性のあるウレアーゼが体液から検出された。このウレアーゼと同様に、体内に取り込まれるクワ蛋白を検索した。その結果、ビオチン標識したクワ葉由来の29K及び32K蛋白が、体内に取り込まれて、体液中に存在することが明らかになった。

Research Products

• [Publications] Kotani, E.: "De novo expression and antisense inhibition in cultured cells of BmTRN-1, cloned from the mudgut of the silkworm, Bombyx mori"Gene. 320. 67-79 (2003)
• [Publications] Konno, K.: "Papain protects papaya trees from herbivorous insects : role of cysteine proteases in latex"The Plant J.. 37. 370-378 (2004)