2004 Fiscal Year Annual Research Report
プロリンアナログを解毒する酵母の新規N-アセチル化酵素の構造機能解析と利用研究
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15380076
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| Research Institution | Fukui Prefectural University |
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Principal Investigator |
高木 博史 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (50275088)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 正和 福井県立大学, 生物資源学部, 助手 (80315837)
小田 順一 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (50027041)
日び 隆雄 福井県立大学, 生物資源学部, 講師 (00285181)
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| Keywords | 酵母 / N-アセチルトランスフェラーゼ / アゼチジン-2-カルボン酸 / プロリンアナログ耐性 / 酸化ストレス / 活性酸素種 / 冷凍ストレス |
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| Research Abstract |
酵母Saccharomyces cerevisiaeΣ1278b株に見いだしたMPR1遺伝子は、プロリンアナログのアゼチジン-2-カルボン酸を解毒する新規N-アセチルトランスフェラーゼをコードしており、熱ショックや過酸化水素で生じる細胞内の活性酸素種(ROS)レベルを下げて、酵母を酸化ストレスから保護している。冷凍ストレス(冷凍/解凍処理)により酵母細胞内にフリーラジカルが大量に発生するという報告から、冷凍ストレスも「酸化ストレス」の一種であると考えられる。そこで、冷凍ストレスにおけるMpr1Pの機能を解析した。MPR1を保持するΣ1278b株と保持しないS288C株の細胞を冷凍し、解凍後の細胞内ROSレベルを測定した。その結果、両菌株のROSは冷凍前に比べて2-3倍に増加しており、冷凍ストレスは酸化ストレスであることが示された。また、Σ1278b株のMPR1を破壊すると、野生株より1.5倍にROSが増加しており、冷凍後の生存率も著しく低下した。一方、S288C株にMPR1を多コピーで導入すると、ROSレベルが50%に減少したことから、Mpr1Pは冷凍ストレスで生じるROSレベルを下げて、酸化ストレスを緩和すると考えられた。
また、Mpr1Pの結晶化に必要なサンプルを調製する目的で、大腸菌による組換え酵素の発現と精製の条件検討を行なった。ベクター(TAGyme pQE-2)にMPR1のopen reading frameを組み込んだ発現プラスミドを構築し、大腸菌JM109株に導入後、IPTGで発現を誘導した。その結果、遺伝子産物はおもに可溶性画分に回収されたので、Ni-NTAカラムで精製後、DAPaseを作用させHisタグの除去を試みた。反応後の試料をNi-NTAカラムに吸着後、洗浄、溶出したところ、カラム未吸着画分にタグが除去されたと考えられるMpr1pが検出できた。
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