新規ユニバーサル選択法を基盤とする超高親和力抗体の創製と超微量分析法への応用

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15390180
• Research Institution: Kobe Pharmaceutical University
• Principal Investigator: 小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 後藤 順一 東北大学, 病院・教授 (80006337) ; 森田 いずみ 神戸薬科大学, 薬学部, 助手 (20299085) ; 小山 淳子 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (60102109)
• Keywords: 抗体 / 一本鎖Fvフラグメント / ファージディスプレイ / ファージ抗体 / 親和力 / 遺伝子工学 / cleavableビオチン / 選択法

Research Abstract

近年、遺伝子工学により天然の抗体を上回る高親和力の変異抗体を得ることが可能視されている。抗体一本鎖Fvフラグメント(scFv)の遺伝子を調製し、ランダム変異を導入したのちファージ粒子上に発現させてライブラリーを構築する。これらを固相に固定化した目的抗原と反応させ、非特異的なファージ抗体を洗浄した後、抗原抗体反応を解離させて吸着された微量のファージ抗体を選択的に回収するものである。しかし、高親和力のフアージ抗体を固定化抗原から解離、溶出させることは極めて困難なため、実際には成功例は皆無に等しい。こうした問題を解決するために、cleavableビオチン(CB)標識抗原を用いる新規なユニバーサル抗体選択法の確立を試みた。その一環として、臨床診断の指標として重要な2種のステロイド、11-デオキシコルチゾール及び17α-ヒドロキシプロゲステロンをモデル抗原として取り上げ、その4位にCBを標識した誘導体を合成した。まず、これら4-en-3-one型ステロイドを4,5-エポキシドを経由して4-カルボキシエチルチオ誘導体に変換した。ついで,N-Boc-ethylenediamineを反応させて側鎖を伸長した後、保護基の除去、スルホコハク酸イミドエステル基を有するCB試薬との反応により、目的のCB標識体を得た。これらは対応する抗ステロイド抗体及びストレプトアビジンと同時に結合し、しかもステロイド核とビオチン核を結ぶスペーサーに含まれるSS結合は、50mMのジチオスレイトール(DTT)で容易に切断された。したがって、ファージ抗体ライブラリーをこれらCB標識抗原と反応させた後に固定化アビジンで捕捉し、DTTでSS結合を切断することにより、目的のファージ抗体をその親和力にかかわらず回収することが可能と期待される。

Research Products

• [Publications] Norihiro Kobayashi: "Idiotype-antiidiotype-based noncompetitive enzyme-linked immunosorbent assay of ursodeoxycholic acid 7-N-acetylglucosaminides in human urine with subfemtomole range sensitivity"Journal of Immunological Methods. 272. 1-10 (2003)
• [Publications] Norihiro Kobayashi: "Monoclonal anti-idiotype antibodies recognizing the variable region of a high-affinity antibody against 11-deoxycortisol. Production, characterization and application to a sensitive noncompetitive immunoassay"Journal of Immunological Methods. 274. 63-75 (2003)
• [Publications] Pi Sun: "Design and synthesis of 6α-corticosteroid haptens and their bovine serum albumin (BSA) conjugates"Chinese Chemical Letters. 14. 259-262 (2003)
• [Publications] Junko Koyama: "Capillary electrophoresis for simultaneous determination of emodin, chrysophanol, and their 8-β-D-glucosides"Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 51. 418-420 (2003)
• [Publications] Junko Koyama: "Correlation of redox potentials and inhibitory effects on Epstein-Barr virus activation of naphthoquinones"Cancer Letters. 201. 25-30 (2003)
• [Publications] Nariyasu Mano: "Presence of protein-bound unconjugated bile acids in the cytoplasmic fraction of rat brain"Journal of Lipid Research. 45. 295-300 (2004)
• [Publications] Nariyasu Mano: "Analysis of the antigen binding site of anti-deoxycholate monoclonal antibody using novel affinity labeling reagent, acyl adenylate"Biochemistry. 43. 2041-2048 (2004)
• [Publications] Mitsunobu Okuyama: "Enzyme-linked immunosorbent assay for monitoring toxic dioxin congeners in milk based on a newly generated monoclonal anti-dioxin antibody"Analytical Chemistry. in press.
• [Publications] 伊藤允好, 萩中 淳 編: "薬学機器分析 第3版"廣川書店. 340 (2004)