新規遺伝子破壊法:RNAi法による血管新生因子抑制を利用した腫瘍増殖抑制

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15390420
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 深井 一郎 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 講師 (10244550)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 昌玄 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 助手 (90363928) ; 矢野 智紀 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 助手 (40315883) ; 藤井 義敬 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 教授 (40156831) ; 水野 幸太郎 名古屋市立大学, 大学院・医学研究科, 助手 (60363941)
• Keywords: 血管新生 / VEGFレセプター / RNAi / in vivo形質導入

Research Abstract

本研究では、最終的に転移性肺腫瘍モデルマウスに対してVEGF(vascular endothelial growth factor)受容体に対するsiRNAもしくはその発現プラスミドをin vivo形質導入を行う計画であるので、まず始めにマウスVEGF受容体1(VEGFR1)をターゲットとするsiRNAを設計した。
マウスVEGFR1のmRNA配列内にsiRNAのターゲットとなりうるAA(N19)の配列は245箇所に存在するが、発現プラスミドの作製に移行した際にこのプラスミド上のU6プロモーターをドライブするPolIII系のinitiation配列であるG(N17)C(N2)をとり、かつtermination codonであるA6を含まない配列を検索すると4つの候補配列が見つかった。この各々の配列に対して米国Ambion社siRNA Construction Kitを用いて二本鎖RNAを作製した。
次に、siRNAの効果を評価するためにin vitro assay系を作製した。VEGFR1および2を発現しているマウス膵微小血管内皮細胞株MAS1-VEGFおよびSVR細胞にInvitroge社Oligofectamine reagentを用いてlipofectionを行い、48時間後に細胞を回収、total RNAを精製、Roche社Light Cyclerを用いて定量的RT-PCRを行い、VEGFRのmRNA量を測定し、そのVEGFR遺伝子特異的発現抑制効果を評価した。このassay系を用いて4つの配列のsiRNAの効果を解析すると、最大で60%程度の発現抑制効果を持っていた。VEGF受容体2に対するsiRNAターゲット配列の至適化についても同様にして行った。
これらのsiRNAは血管内皮細胞株のVEGFmRNA発現量を抑制するだけでなく、細胞の増殖能も抑制するためその生理活性も抑制していることが明らかとなった。
現在は、最終目標であるマウスin vino形質導入を行うため更に安定的と考えられるsiRNA発現プラスミドの作製に移っている。