GFP付加α2Aアドレナリン受容体をノックイン発現する新規遺伝子改変マウスの作成

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15390478
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 溝部 俊樹 京都府立医科大学, 医学研究科, 講師 (50239266)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥田 司 京都府立医科大学, 医学研究科, 講師 (30291587)
• Keywords: α2Aアドレナリン受容体 / GFP / トランスジェニックマウス

Research Abstract

今年度の予定は、Lambda phage/mouse 129vev genome libraryのscreeningを行い、入手したα2A adrenoceptor subtype genome cloneをmappingして、targeting vectorの構築を行う予定であったが、幸いなことに、Vanderbilt大学薬理学教室のProf Quin WangよりHA-tagged α2A adrenoceptorを有する遺伝子改変マウスを作るためのtargeting vectorを得ることができたので、これをもとに、α2A AR-GFP遺伝子改変マウスのためのtargeting vectorを構築することにした。提供されたvectorは、14779bpで、8224-9606にHA-tagged α2A ARが、10208-12182にneo cassetteが入っている。HAは、α2A ARの2番目と3番目のアミノ酸の間(8230-8259)に挿入されている。
1)HA tagの除去:SalI(7133bp)部位とHAtag直前にプライマーを設計しPCRを行う。HAtag直後とα2A ARのstopコドンを除きKpnIを付加したプライマーを用いてPCRを行う。このフラグメントをPCRにて合成しクローニングベクターに導入してシークエンスを行い配列確認されたクローンからSalI、KpnI用いて断片を切り出し精製する。
2)EGFPの合成:EGFPの開始コドンの前にKpnIサイトを付加したプライマー及び、Stopコドンの直後にSfiIサイトを付加したプライマーを用いてEGFP遺伝子を増幅しクローニングベクターに導入してシークエンスを行い配列確認されたクローンからKpnI、SfiI用いて断片を切り出し精製する。
3)Targeting vectorの構築:元のDNAをSalI、SfiIで制限酵素処理しSalI--SfiI断片を除去する。1,2のDNA断片をこのSalI、SfiIサイトへ導入する。
4)ローカス類似配列の除去:3で得られたクローンをMunI、XhoIで制限酵素処理を行い末端を平滑化し、セルフライゲーションを行う。
現在、上記作業の1,2を行っており、順調にいけば6月頃には、targeting vectorが完成する予定である。その後、当初の予定通り、ES cellへのelectropolationを行い、screeningの作業に入る。