GFP付加α2Aアドレナリン受容体をノックイン発現する新規遺伝子改変マウスの作製

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15390478
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 溝部 俊樹 京都府立医科大学, 医学研究科, 講師 (50239266)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 奥田 司 京都府立医科大学, 医学研究科, 准教授 (30291587)
• Keywords: α2アドレナリン受容体 / GFP / 遺伝子改変マウス

Research Abstract

1)キメラマウスの作成
昨年度得られたF1ヘテロマウスを用い交配を行い、以下の要領でgenotypingを行った。
2)genotyping
NEO遺伝子の確認は、3つのプライマーを用いてPCRにて行った。すなわち、Wild type gene上に存在するforward primer (1),backward primer (II),そしてNeo上に存在するforward primer (III)である。(1)(II)にて533bp(wild type),(II)(III)にて273bp (homo)のPCR fragmentが得られる(heteroでは2つのバンド)。また、EGFP遺伝子の確認は、EGFP上に存在する2つのプライマーを用いてPCRにて行った。
結果:オス28匹中、8匹がwild type、20匹がhetero typeであった。また、メス29匹中、8匹がwild type、21匹がhetero typeであった。しかしHomo typeは得られなかった。
3)免疫組織化学
hetero type3匹を使って脳におけるGFPの発現を蛍光顕微鏡にて確認したところ、2匹では蛍光は血管にのみ認められ神経細胞での発現はなかった。1匹では神経細胞、さらには青斑核での発現を認めたが、蛍光強度は弱かった。以上の結果から、このcell Iineのマウスでは、α2Aアドレナリン受容体-GFP癒合蛋白の発現が何らかの原因で傷害されており。このマウスでは機能解析は困難と考え、別のcelllineのマウスを再度作り直す事にした。
4)Electropolation-Microinjection
targeting vectorをmouse strain 129SvEv由来のES細胞に再度、electropolationし、screeningし、陽性クローンをmicroinjectionした。
5)F1ヘテロ
キメラマウスから、F1ヘテロマウスを得た。現在、F1ヘテロマウスの交配中である。
ヘテロマウスの作成をやり直すこととなり、年度内にはα2Aアドレナリン受容体一GFP癒合蛋白の機能解析はできなかった。従って現時点で発表できる業績はないが、F1ヘテロとはいえ、このような遺伝子改変マウスは我々しか作成しておらず、このマウスの存在だけでも大きな業績と考える。しかし今後もこの実験を続け、ホモマウスが得られたら、予定通り機能解析を行う予定である。また、他施設との共同研究も行う予定である。