2003 Fiscal Year Annual Research Report
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15390525
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
天野 史郎 東京大学, 医学部附属病院, 助教授 (80193027)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田邊 樹郎 東京大学, 医学部附属病院, 助手 (00359605)
臼井 智彦 東京大学, 医学部附属病院, 助手 (80282557)
山上 聡 東京大学, 医学部附属病院, 助教授 (10220245)
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| Keywords | 角膜 / 再生医療 / 角膜上皮細胞 / 角膜内皮細胞 |
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| Research Abstract |
平成15年度に以下のような研究結果を得ることができた。まずバイオ再生角膜に応用可能な角膜組織からの組織幹細胞の分離を幹細胞分離法の一つであるスフェア法を用いて試みた。アメリカアイバンクのドナー角膜より角膜輪部組織、デスメ膜ごと内皮細胞を採取し、コラゲナーゼを添加した細胞分離用培地で組織を溶解させ、EDTA/PBS溶液で細胞を分散させた。単一細胞に分散した細胞は凝集を防ぐ為、メチルセルロース添加無血清培地中7日間浮遊培養を行った。またDiIによる染色細胞と非染色細胞を1:1で混合し、増殖細胞の単一細胞起源の証明を試みた。分離されたスフェアよりRNAを抽出し、RT-PCR法を用いて遺伝子発現の解析、および免疫染色を行った。その結果、角膜輪部組織および角膜内皮より採取した細胞から浮遊培養中に球状の細胞塊を作るものが存在することを確認した。DiI染色と未染色の細胞を混合した後、浮遊培養により単一細胞から作成された細胞塊がDiI陽性、非陽性に別れたことから、この細胞塊が単一細胞起源のスフェアであることが判明した。スフェア形成率は角膜輪部が10000cellあたり2.8個であった。角膜内皮では15.9であった。角膜輪部由来のスフェアは未分化細胞マーカーであるネスチンがRT-PCR法と免疫染色法で検出された。この結果より、ヒト角膜輪部組織および内皮細胞より単一細胞起源のスフェアが分離でき、組織幹細胞である可能性が示唆された。ウサギ角膜内皮より同様のスフェア法にて内皮スフェアを作成し、ウサギ前房内に投与したところ、内皮面に広がり機能することが確かめられた。バイオ再生角膜に応用可能なブタ角膜実質の無細胞化は、酵素法などよりも、実質を100%に近い窒素に1週間密閉しておくことで可能のなことが確認された。
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