角膜疾患に対する温度応答性ポリマーを用いた培養細胞シート移植の開発

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15390530
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 西田 幸二 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (40244610)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田野 保雄 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (80093433) ; 渡辺 仁 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (60252673) ; 岡野 光夫 東京女子医科大学, 先端生命医科学研究所, 教授 (00130237)
• Keywords: 再生医療 / 温度応答性培養皿 / 角膜上皮 / 角膜内皮 / 幹細胞 / 培養 / 口腔粘膜

Research Abstract

これまでの角膜移植の予後不良な疾患として、熱・化学腐蝕、スチーブンス・ジョンソン症候群や眼類天疱瘡などの難治性角結膜上皮疾患および角膜内皮細胞障害で生じる水疱性角膜症がある。本研究ではこれらの疾患に対する新しい治療法として、患者自身の細胞を用いた再生治療法を開発する。
難治性角結膜上皮疾患に対する再生治療法として、培養細胞シート移植法の開発を行った。温度応答性培養皿上でヒト角膜上皮幹細胞(アメリカからの実験用輸入角膜を使用)、ウサギ角膜上皮幹細胞を増殖させ重層化した角膜上皮シートを作成することができた。また角膜上皮の代用細胞として、ウサギ口腔粘膜細胞を採取して、口腔粘膜シートを作製した。低温度処置にてこれらの再生上皮シートを回収する方法を確立した。回収した細胞シートを組織学的(光学顕微鏡、電子顕微鏡)、免疫組織化学的、生化学的(ウェスタンブロット)で検討したところ、in vivo角膜上皮と類似の構造をしていることがわかった。また、細胞外マトリックスや接着タンパクが障害されずに保持されていることが証明された。さらに、コロニーアッセイにより、培養細胞シートの中には上皮幹細胞が温存されていることが証明された。これらの結果は、培養細胞シート移植の臨床的有用性を示唆している。
水疱性角膜症に対しては、培養角膜内皮シート移植の開発を行った。in vivoヒト内皮細胞はG1期にある細胞で、生体内では細胞分裂しない。まず、ヒト内皮細胞の初代培養方法を確立するため、過去の文献を参考に、ヒト角膜内皮細胞を、種々の条件で培養した。その結果、正常角膜内皮層と同程度の細胞密度を得ることができる培養方法を発見することができた。

Research Products

• [Publications] Nishida K: "Tissue engineering of the cornea"Cornea. 22. S28-S34 (2003)
• [Publications] Nishida K et al.: "Functional bioengineered corneal epithelial sheet grafts from corneal stem cells expanded ex vivo on a temperature-responsive cell culture surface"Transplantation. 77. 379-385 (2004)