細菌鉄結合蛋白X線結晶構造解析からの新規抗菌薬の創製に向けて

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15390566
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 苔口 進 岡山大学, 大学院・医歯学研究科, 助教授 (10144776)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高柴 正悟 岡山大学, 大学院・医歯学研究科, 教授 (50226768) ; 井上 哲圭 岡山大学, 大学院・医歯学研究科, 助手 (20223258) ; 福井 一博 岡山大学, 大学院・医歯学研究科, 教授 (70034171) ; 前田 博史 岡山大学, 大学院・医歯学研究科, 助手 (00274001) ; 西村 英紀 岡山大学, 大学院・医歯学研究科, 助教授 (80208222)
• Keywords: 歯周病細菌 / 病原細菌 / 鉄結合蛋白 / リコンビナント蛋白 / 蛋白質結晶化 / X線結晶構造解析

Research Abstract

本研究課題では、歯周病細菌Actinobacillus actinomycetemcomitansや病原細菌Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureusの増殖と病原性発現に関わる鉄獲得系の鉄結合蛋白の立体構造と機能解析を行ない、その成果から新規抗菌薬の創薬を目指すものである。本年度はまず病原細菌鉄結合蛋白の大量発現系の構築、リコンビナント蛋白の精製系の確立を目指した。すなわち、1)申請者らが報告した歯周病細菌A. actinomycetemcomitansの鉄結合蛋白fbp遺伝子(DDBJ D89339)とフェリチンftn遺伝子(DDBJ AB004902)およびdps遺伝子(DDBJ AB080734)さらに鉄獲得制御蛋白fur遺伝子(DDBJ AB048712)を基にリコンビナント蛋白大量発現系プラスミドを構築した。
2)S. pyogenes, S. pneumoniae, S. aureusについては、Yamamoto YらがStreptococcus mutansの鉄結合蛋白として報告したDpr分子(J Bacteriol.2002;184(11):2931-9)のアミノ酸配列と相同性のある遺伝子をゲノムデータベースより検索した。それぞれの遺伝子断片をPCRで増幅し、クローニングベクターに組み込み陽性クローンを選択した。さらに現在発現ベクターへの組換えを行なっている。
3)それぞれの病原細菌のリコンビナント細菌鉄結合蛋白が大腸菌で十分に発現できたものから、結晶化に向けての精製を進めている。設備備品として蛋白質精製装置アマシャムファルマシアバイオテク・AKTAprimePCを購入し、リコンビナント蛋白の迅速で効率の良い精製系を構築中である。

Research Products

• [Publications] Inoue T, Shingaki R, Sogawa N, et al.: "Biofilm formation by a fimbriae-deficient mutant of Actinobacillus actinomycetemcomitans"Microbiol.Immunol. 47・11. 877-881 (2003)
• [Publications] Maeda H, Fujimoto C, Haruki Y, et al.: "Quantitative real-time PCR using TaqMan and SYBR Green for A. actinomycetemcomitans, P.gingivalic, P.intermedia, tetQgene and total bacteria"FEMS Immunol.Med.Microbiol. 39・1. 81-86 (2003)
• [Publications] Wilde C, Escartin F, Kokeguchi S, et al.: "Transposases are responsible for the target specificity of IS 1397 and ISKpn1 for two different types of palindromic units (Pus)"Nucleic Acids Res.. 31・15. 4345-4353 (2003)
• [Publications] Fujimoto C, Maeda H, Kokeguchi S, et al.: "Application of denaturing gradient gel elelectrophoresis(DGGE) to the analysis of microbial communities of subgingival plaque"J.Periodontal Res.. 38・4. 440-445 (2003)
• [Publications] Mineshiba F, Takashiba S, Mineshiba J, et al.: "Antibacterial activity of synthetic human β defensin-2 against periodontal bacteria"J.Int.Acad.Periodontol. 5・2. 35-40 (2003)