G蛋白共役型明容体のヘテロマー形成、並びに受容体の細胞膜移行を司る因子の検索

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15500262
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 上園 保仁 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 講師 (20213340)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 谷山 紘太郎 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (70030898) ; 澁谷 泉 産業医科大学, 医学部, 助教授 (50162649)
• Keywords: GABA-B受容体 / G蛋白共役型受容体 / heterodimerization / Xenopus oocyte / FRET / heterologous expression / Electrophysiology / 共焦点レーザー顕微鏡

Research Abstract

本研究は、クローン化GABA-B受容体(GABAB1R+GABAB2R),ヘテロマー形成受容体(μ-opoidR+δ-opioidR)を発現させた細胞を用いて、4つの異なるアッセイ系を組み合わせて検討を行う。
すなわち、(1)発現受容体の細胞内局在を免疫組織学的、ならびに共焦点レーザーを用いて特定し、(2)発現受容体の多量体化・複合体化をウェスタンブロット法、ならびにFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)を用いて可視化し、(3)GABA-B,μ-opoidR+δ-opioidR受容体刺激後のシグナル伝達機構を電気生理学的にアッセイし、(4)さらにはGABA-BR,μ-opoidR,δ-opioidRのように通常カルシウム動員を惹起しないGPCRについても、キメラG蛋白と受容体とを融合させたクローンを発現させることで受容体シグナルをカルシウムイメージングによって簡便にアッセイする。
これらにより、GPCRの多量体・複合体化と細胞内局在、受容体機能との連関を総合的に解析しようとするものである。これらのシステムを用いて、受容体複合体化・多量体化に影響を与える因子を検索するとともにその作用メカニズムの解析を行う。
(1)については、共焦点レーザ顕微鏡を用いて、細胞膜上に機能的受容体が発現する際にはすでに細胞内で受容体が複合化しているという知見を得た。(2)については、GABAB1aR-CFP,GABAB2R-V\YFPクローンを用いて、この両者がdimerizationを起こして細胞膜に発現していることをFRETにて確認できた。さらにはFRETを定量化できるマルチ蛍光メーターを用いて、アゴニスト投与における受容体Dimerizationの変化についてもリアルタイムで測定できるよう、にアッセイ系を最適化した。(3)については、GABAB-1R、GABAB-2Rをツメガエル卵母細胞に発現させ、GABAの結合に必要な受容体はGABAB1aRサブタイプ、また、シグナルを下流に伝えるのに必要なサブタイプはGABAB2Rが担っていることを証明した。また(4)について、受容体-キメラG蛋白融合体を用いてさらに感度の高い、簡便なアッセイを行うことに成功した(投稿準備中)。次年度はこの4つのアッセイ系をフルに活用し、受容体ヘテロマー形成を調節する因子について詳細なアッセイと検索を行っていく。

Research Products

• [Publications] MINAMI, K., UEZONO, Y., SHIRAISHI, M., OKAMOTO, et al.: "Analysis of the effects of anesthetics on the function of Gi-coupled muscarinic M2 receptors expressed in Xenopus oocytes using a chimeric Gα protein"Pharmacology. (In Press). (2004)
• [Publications] KAWAKAMI, S., UEZONO, Y., MIKIMOTO, N., ENJOJI, A., et al.: "Characterizarion of GABAB receptors involved in inhibition of motility associated with acetylcholine release in the dog small intestine"Journal of Pharmacological Sciences. (In Press). (2004)
• [Publications] UEZONO, Y., KAIBARA, M., KAWAKAMI, S., et al.: "Expression of GABAB receptors in the human colon"Journal of Pharmacological Sciences. 94(2). 211-213 (2004)
• [Publications] OGATA, J., MINAMI, K, SEGAWA, K., UEZONO, Y., et al.: "A forskolin derivative, colforsin daropate hydrochloride, inhibits the decrease in cortical renal blood flow induced by noradrenaline or angiotensin II in anesthetized rats"Nephron Physiol. 96(2). 59-64 (2004)
• [Publications] SHIRAISHI, M., MINAMI, K., SHIBUYA, I., OKAMOTO, T., UEZONO.Y., et al.: "Inhibitory effects of alphaxalone on M1 and M3 muscarinic receptors expressed in Xenopus oocytes"Anesthesia and Analgesia. 97. 449-455 (2003)
• [Publications] 上園保仁, 貝原宗重, 林日出喜, 谷山紘太郎: "消化管運動とセロトニン"Clinical Neuroscience. 21(6). 656-657 (2003)