哺乳類生殖細胞への毒性を低減した、耐凍剤を用いない凍結保存法開発の基礎研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15500302
• Research Institution: 宮崎医科大学
• Principal Investigator: 越本 知大 宮崎大学, 医学部・フロンティア科学実験総合センター, 助教授 (70295210)
• Keywords: 凍結保存 / 耐凍剤 / 細胞膜透過性 / 精子 / 凍結速度 / 融解速度

Research Abstract

細胞凍結保存の必須条件とされている耐凍剤添加の是非を問い直し、従来不可能とされていた種の精子凍結法を開発するための基礎的知見を集積する目的で、第一年目は以下の実験を行った。
1、一般細胞に比較して複雑な形状である精子細胞の物理的パラメータ(体積、細胞膜の物質透過性等)の簡便で正確な測定法を検討した。
2、数種類の齧歯類精子の浸透圧感受性を測定し、その結果から膜を透過する耐凍剤無添加の溶液を設計した。
1に関しては実験計画書で候補にあげた方法のうちフローサイトメーターによる測定が有効であるとの結論に至った。本法を用いて不定型の精子細胞の体積を短時間で簡便にトレースすることが可能となり、現在は引き続いて浸透圧変化に対する細胞体積変化を経時的に追跡する方法の検討に入っている。これが完了すれば細胞膜の物質透過性を算出することができ、凍結過程の浸透圧変化に対応した細胞の収縮膨張を模擬的に試験することが可能となるため、適切な凍結融解速度を理論的に予測することが可能となる。2に関しては、新しい実験動物であるスナネズミ3種類の精子をモデルとして浸透圧感受性試験を行い、スナネズミ3種の精子の間に感受性の差があることを確認した。また、その結果をもとに細胞に浸透しない糖を添加した溶液をそれぞれ設計して凍結試験を行ったところ、3種類全ての精子が凍結融解後に生存することを確認し、現在、凍結融解精子を用いた受精能の検討に入っている。このようにスナネズミにおいて種間による浸透圧耐性違いを反映して設計した溶液が機能した事実は、マウスの系統間でみられる精子耐凍性の差を克服する基礎的な知見になると考える。