2003 Fiscal Year Annual Research Report
新しい哺乳動物の酸化ピリミジン修復グリコシラーゼの機能解明
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15510059
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
久保 喜平 大阪府立大学, 農学生命科学研究科, 教授 (40117619)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宇井 雅博 大阪府立大学, 農学生命科学研究科, 助手 (10336810)
松山 聡 大阪府立大学, 農学生命科学研究科, 助教授 (10254442)
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| Keywords | DNA修復 / 活性酸素 / グルコシラーゼ / 塩基損傷 / 脱塩基部位 / チミングリコール / 塩基除去修復 / 哺乳動物 |
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| Research Abstract |
1)チミングリコールグリコシラーゼ活性の精製のために、単離核の高調処理により核抽出液を作成し、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィおよびUNO-Sカラムクロマトグラフィーによる精製を行った。UNO-Sカラム画分を、SDS-PAGEにより解析し、その量が活性と相関する候補バンドを選んだ。このうち、その量と活性とが最も相関するバンドは、数回の精製サンプルに共通して観察され、みかけの分子量は約38,000と計算された。候補活性は、mNTHと分画されることは確認済みであるが、mNEIL1のアイソフォームや分解産物の可能性も考えられるため、アミノ酸配列の決定を試みた。まず、BSA添加後にカラム活性画分を濃縮し、SDS-PAGE後、ナイロンメンブレンに転写した。候補バンドを切り出し、プロテインシークエンサにより解析を試みたが、アミノ末端がブロックされていると推測された。そこで、このバンドを含む複数の候補バンドを切り出し、トリプシン消化後、MALDI-TOF質量分析装置により解析した。この結果、mNEIL1を含む複数のタンパクが検出されたが、第一候補バンドはBSA由来アネキシンと重複したため、同定にはいたらなかった。そこで、濃縮した活性画分の二次元電気泳動を行い、等電点および分子量から候補スポットを選択し、MALDI-FTICRによる解析を行った。この結果、サンプル中に、複数の未同定スポットが見出され、これらの精製解析を行っている。
2)細胞内DNA中の酸化損傷由来の脱塩基部位を解析するために、Fluorescent-ARP(FARP-1)を新たに開発し、DNA抽出を必要としないFCMによる定量法を開発した。
3)得られたチミングリコールDNAグリコシラーゼのファージディスプレイ法による組み換えモノクローナル抗体の作成条件を検討した。
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