2003 Fiscal Year Annual Research Report
ライブラリーのスクリーニングに基づく生体機能分子のデザインと解析
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15510184
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| Research Institution | Osaka Medical College |
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Principal Investigator |
矢野 貴人 大阪医科大学, 医学部, 講師 (40239827)
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| Keywords | directed evolution / 進化工学 / de novo design / タンパク質デザイン / 抗生物質耐性 |
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| Research Abstract |
1 ライブラリーのスクリーニング
2ステップ目のスクリーニングで、以下のような繰り返しアミノ酸配列を持つタンパク質の発現ライブラリーを大腸菌内で構築する手法を新たに確立した:
(Gly-Gly-X1-X2-X3-Gly-X4-Pro-X5-X6-Asn-Ala)n
X1,Ile,Leu,Val,or Phe;X2,Ser or Thr;X3,Ile,Leu,Val,or Phe;X4,Ala or Gly;X5,Arg or His;X6,Glu or Val;n>10
スクリーニングの結果、大腸菌内で完全に可溶性のタンパク質を発現するクローンを9個得ることができたので、その塩基配列を決定した。その結果、各X部位に高頻度で現れるアミノ酸残基にはある傾向が存在することがわかった。また、これらのクローンについて、より繰り返し回数の多いタンパク質の作製・発現を試みた。その結果、あるクローンは50回以上繰り返しても、可溶性のタンパク質を大腸菌内で発現することがわかった。
2 可溶性タンパク質の精製
可溶性のクローンのいくつかは、溶菌液中に十分量のタンパク質を発現していた。C末端にHisタグを付加したものを作製し精製を試みたところ、His-bind Resinおよびヒドロキシアパタイトの2ステップで、充分な純度の精製品を得ることが出来た。また、His-bind Resinで精製直後の試料をそのまま保存しておくと、おそらく混在するプロテアーゼにより消化され、繰り返し単位に相当する断片のラダーがSDS-PAGEゲル上で観察された。この混在プロテアーゼはヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィーにより完全に除去することができた。
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