光化学系葬を熱安定化した組換えシアノバクテリアからの酸素発生最小複合体の精製

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15560682
• Research Institution: Sojo University
• Principal Investigator: 松岡 正佳 崇城大学, 工学部, 助教授 (10121667)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小川 隆平 崇城大学, 工学部, 教授 (40029244)
• Keywords: 光化学系II / シアノバクテリア / Synechococcus elongatus / シャペロン / D1-D2ヘテロダイマー / 熱安定化 / 酸素発生

Research Abstract

1.光化学系II遺伝子組換えシアノバクテリアの作成:中温性シアノバクテリアSynechococcus elongatus PPC 7942の光化学系II反応中心タンパク質D1とD2をコードするpsbAIおよびpsbDI遺伝子座へ好熱性シアノバクテリアThermosynechococcus vulcanusのpsbA1およびpsbD1遺伝子のコード領域を組み込むためのプラスミドを作成した。これらのプラスミドを用いてrps12媒介遺伝子置換法により順次S.elongatusを形質転換し、染色体上のpsbA1遺伝子座だけが置換された一重変異株、およびpsbA1とpsbD1遺伝子座が置換された二重変異株を作成した。組換え株のNorthern分析およびWestern分析を行った結果、好熱菌由来の遺伝子の転写量は宿主と比べて変化していなかった。しかし、一重変異株のチラコイド膜には好熱性D1タンパク質はほとんど組み込まれておらず、D1-D2ヘテロダイマーのアセンブリーが正常に進行していないことが考えられた。現在、二重変異株における好熱性D1サブユニットの発現を確認中である。
2.好熱性シアノバクテリア由来HspAシャペロンの精製:T.vulcanus由来のHspAシャペロンをコードするhspA遺伝子のコード領域にヒスチジンタグを付加し、大腸菌araBADプロモーターの下流に組み込んだプラズミドを構築した。このプラスミドによる大腸菌形質転換体をL-アラビノースにより誘導し、細胞破砕液上澄よりHspAタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製したHspAタンパク質の単量体分子量は16kDaであり、モデル基質であるリンゴ酸脱水素酵素のin vitro熱変性における凝集を防ぐ効果を示した。今後、光化学系IIタンパク質の熱凝集回避のために用いる。

Research Products

• [Publications] Takahama K., Matsuoka, M., Nagahama, K., Ogawa, T.: "High-frequency gene replacement in cyanobacteria using a heterologous rps12 gene"Plant Cell Physiol.. Vol.45,No.3(in press). (2004)