炭酸固定活性化酵素の改変によるイネ葉光合成機能の強化

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15580012
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 畠中 知子 神戸大学, 農学部, 助手 (40254461)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 内田 直次 神戸大学, 農学部, 助教授 (70151884)
• Keywords: イネ / Rubisco activase / 野生種 / 形質転換 / 炭酸固定 / 光合成

Research Abstract

イネのジャポニカ種(品種、Nipponbare)のRubisco activaseのcDNAをクローニングし、CabプロモーターにつないたT-DNAベクターを構築した。このT-DNAベクターを、アグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)EHA101系統に凍結融解法により導入した。
次にイネ種子(Oryza sativa L.Nipponbare)からカルスを誘導し、上記ベクターを持つアグロバクテリウムを感染させ、ハイグロマイシンによって形質転換個体を選抜した。現在までの段階ではまだ植物体再生には至っていないので、引き続き培養を行い、選抜個体についてはPCRによる導入遺伝子の検出とゲノミックサザン解析を行い、形質転換体であることを確認する予定である。
イネ野生種6種と栽培種2種の葉のCO_2-光合成曲線から炭酸同化効率を算定するとともに,Rubisco activaseを免疫定量した。また、ウエスタンブロッティングにより同酵素の変異を調べた。野生種Oryza australiensisは栽培種より炭酸同化効率およびRubisco activase含量が有意に高く,in vivoのRubisco活性化率が優れていると考えられた。また,Rubisco activaseのポリペプチド組成も異なることが観察された。
既知のイネ科植物のRubisco activaseの塩基配列およびアミノ酸配列から保存性が高い領域を特定し、縮合プライマーを作成した。O.sativaとはゲノムタイプの違うO.australiensisのRNAを鋳型にRT-PCRを行い、増幅された断片の塩基配列を決定した。この配列を元に新たにプライマーをデザインし、5'-および3'-RACE法(Rapid amplified of cDNA ends)によって翻訳領域の全長の配列を2種類決定した。決定した配列を比較したところ、どちらもO.sativaのRubisco activaseの配列と高い相同性を示した。