超高分解能X線結晶構造解析に基づくエンドポリガラクツロナーゼの反応機構の解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15580072
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 宮入 一夫 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (10003526)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉田 孝 弘前大学, 農学生命科学部, 助教授 (80200997) ; 加藤 博章 京都大学, 薬学研究科, 教授 (90204487)
• Keywords: エンドポリガラクツロナーゼ / 一般酸・塩基触媒 / 原子分解能X線結晶構造解析 / Stereum purpureum

Research Abstract

○結晶化に用いる精製EndoPG Iの調製とEndoPG Iの一般酸・塩基触媒残基のpKaの決定
Stereum purpureumの培養濾液からエンドポリガラクツロナーゼ(EndoPG)をCM52とゲル濾過による方法でSDS-PAGE的に均一に精製した。この標品を用いてEndoPG Iの反応機構の解明に必要な一般酸・塩基触媒残基のpKaをDixon Plot法で測定した。その結果pKa1は4.35、pKa2は5.4と測定された。このことから一般酸触媒残基と考えられるAsp173はpH5.4で解離しており、一般塩基触媒候補のAsp153とAsp174のいずれかはpH4.35で解離していることが明らかになった。
○3つの異なるpHでの結晶の作成
決定されたpKaから、二つの活性残基の水素が、両方とも解離する状態、塩基触媒のみ解離する状態、両方とも解離しない状態、の3つの結晶を作成した。すなわち一般酸触媒残基のpKaより上、一般酸触媒残基と一般塩基触媒のpKaの中間、一般塩基触媒残基のpKaより下、の3つの緩衝液に結晶を浸漬し各pHの結晶を調製した。これらを用いて各結晶の原子分解能回折強度データをSPring 8において収集し、水素を含む構造解析を行った。
○EndoPG I大量発現系の構築と発現酵素の性質
これまでEndoPG Iを手に入れるためにStereum purpureumを培養し、この培養濾液から精製する方法を取ってきた。これに代わる方法としてEndoPG I cDNAを発現用プラスミド大腸菌:pET 11bにライゲーションし、大腸菌DH5αとOrigamiに形質転換した。その結果、1mM IPTGで誘導をかけたOrigamiにのみEndoPGが菌体中に生産されたのを確認した。この菌体から超音波破砕により酵素を抽出し、CM52の一段階によりリコンビナントEndoPG IをSDS-PAGE的に均一に精製することに成功した。リコンビナントEndoPG IはN-末端アミノ酸配列、ESI-MSによる分子質量すべて脱糖鎖したWild EndoPG Iと一致した。しかし熱安定性、pH安定性の点で糖鎖がついたWild EndoPG Iに比べかなりの低下が認められた。

Research Products

• [Publications] K.Miyairi, * A.Ogasawara, A.Tonouchi, K.Hosaka, M.Kudou, T.Okuno: "Low-Molecular-Weight Pectate Lyase from Streptomyces thermocarboxydus"Journal of Applied Glycoscience. 51・1. 1-7 (2004)
• [Publications] T.Shimizu, T.Nakatsu, K.Miyairi, * T.Okuno, H.Kato: "Reaction Mechanism Based on X-Ray Crystallography at Atomic Resolution of Endopolygalacturonase I from Fungus Stereum purpureum"Journal of Applied Glycoscience. 51・2. (2004)