2004 Fiscal Year Annual Research Report
分泌タンパク質MFG-E8を介した細胞外分泌膜小胞の生成機構および機能解析
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15580075
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
青木 直人 三重大学, 生物資源学部, 助教授 (40242846)
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| Keywords | MFG-E8 / 膜小胞 / discoidin domain |
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| Research Abstract |
COMMA-1D乳腺上皮細胞に加え、HEK293やCaco-2から分泌されるMFG-E8を含む膜小胞は多く、MFG-E8の他にも多くのタンパク質が存在することを高解像度の電気泳動法と銀染色法を組み合わせることにより見出した。膜小胞を大量に調製し、局在するタンパク質を質量分析計を用いて網羅的に解析した結果、これまで他の細胞種から分泌されるexosomeに局在することが報告されているものに加え、それぞれの細胞に特異的なものも含まれていることが判明しつつある。今後はこれらの同定をさらに進めるとともに、その生理的意義の解明に向けてsiRNAを用いたノックダウン実験を試みている。
また膜小胞分泌におけるMFG-E8のもつD-domainの機能解析を行うために、D-domain(D1およびD2)をタンデムに並んだ形で単独に発現する発現プラスミド、あるいはMFG-E8の各ドメインを様々なコンビネーションで持つキメラタンパク質発現プラスミドを構築した。これらをCOS7細胞に一過性に導入し、それら変異体の膜小胞への局在を指標に解析したところ、D2ドメインを2つタンデムに持つ変異体は膜小胞への強い局在を示した。またD-domainをシグナル配列を持つ分泌性タンパク質(例えばαLactoalbumin)のC末端側にD1あるいはD2-domainを単独あるいはタンデムに並んだ形で付加した場合は、予想に反して膜小胞への局在が見られなかった。ところがシグナル配列を持たないタンパク質にD-domainを付加すると一部のタンパク質が膜小胞への局在を示すことが明らかとなった。これが何に起因するのか現在解析を進めているところである。
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