アミロペクチン生合成に関与するデンプン枝切り酵素の分子論的解析

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15580115
• Research Institution: Fukuyama University
• Principal Investigator: 岩本 博行 福山大学, 生命工学部, 助教授 (90213321)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 廣瀬 順造 富山大学, 生命工学部, 教授 (70080215)
• Keywords: アミロペクチン / デンプン枝切り酵素 / プルラナーゼ / イソアミラーゼ / 反応速度論 / X線結晶解析 / 大腸菌での発現系構築 / 変異酵素

Research Abstract

主に穀類を用いたこれまでの研究により、アミロペクチンの生合成には、デンプン枝付酵素、デンプン合成酵素、デンプン枝切酵素の3つが最も重要であると考えられている。このうちデンプン枝切酵素は、アミロペクチンのクラスター構造形成に関わっており、この働きは主としてイソアミラーゼが担うとされている。一方基質特異性の異なるもう一つの枝切り酵素であるプルラナーゼは、発芽時におけるエネルギー獲得のほかに、アミロペクチン生合成にも一定の寄与をしているのではないか、という意見もある。
本研究では、これら2つの植物由来デンプン枝切り酵素(イソアミラーゼとプルラナーゼ)について、その構造や反応機構の違いについて分子論的に明らかにすることを目的とし、平成16年度まではイネおよびジャガイモ由来プルラナーゼについて、反応速度論的な解析等を行った。しかし植物由来イソアミラーゼについては、微生物由来酵素と異なり、多量体構造を持つ非常に不安定な酵素であるため、物理化学的手法を用いた解析が十分にできない。そこで平成17年度は酵素が安定で研究が進めやすい微生物由来酵素に立ち戻り、構造生物学的、タンパク質工学的手法を用いて、両酵素の違いを分子論的に明らかにした。まずKlebsiella由来プルラナーゼほかについて、京都大学の三上らと共同でその立体構造を明らかにした結果、イソアミラーゼとプルラナーゼの特性の違いが、本質的に2つのループ構造に帰納されるとの仮説に至った。そこでこの仮説を確かめるため、酵素遺伝子をクローニングし、これまで成功例がなかった、大腸菌で、可溶性画分に、活性状態で酵素を発現させる発現系の構築に成功した。現在は変異を導入した酵素について、反応速度論的、物理化学的解析を行い、両酵素の特性の違いを分子論的に明らかにしつつある。