癌腫病菌カバノアナタケに対するシラカンバの感染特異的タンパク質の網羅的解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15580119
• Research Institution: Utsunomiya University
• Principal Investigator: 横田 信三 宇都宮大学, 農学部, 助教授 (60210613)
• Keywords: カバノアナタケ / シラカンバ / 菌感染特異的タンパク質 / プロテオーム / 樹病 / 二次元電気泳動 / オキシダティブバースト / 宿主特異的抵抗性

Research Abstract

本研究では、カバノアナタケIO-U1株の感染によって、シラカンバ幼植物体内に生成する感染特異的タンパク質を検出し、データベースを基に検出されたタンパク質の推定を行った。また、以前に用いたIO-B2株の場合と、特異的タンパク質及びそれぞれの場合の防御反応について比較した。カバノアナタケIO-U1株を接種したシラカンバ幼植物体(処理区)、対照区1(無菌・無傷)及び対照区2(傷害)の各植物体を、菌接種後0〜7日間毎日採取した。これらを液体窒素で急速凍結後、粉砕し、タンパク質抽出緩衝液を用いて粗タンパク質溶液を調製した。得られた粗タンパク質溶液をメンブランフィルター濾過及びゲル濾過を行い、色素結合法によってタンパク質含量を測定した後、二次元電気泳動に供した。一次元目の泳動はIPGゲルを,そして二次元目の泳動はExcelGelSDSゲルを用いてそれぞれ行った。泳動後ゲルを銀染色し、乾燥後スキャナーでコンピューターにその画像を取り込み、二次元電気泳動画像解析ソフトウエアImageMaster 2D Eliteを用いて画像解析を行った。IO-B2株感染の場合、感染特異的タンパク質が感染2日目及び5日目に特に多く生成していたことから、本研究でも菌感染後0日目、2日目及び5日目の各粗タンパク質溶液について解析した。その結果、IO-U1株感染特異的タンパク質の総数は、0日目が14個、2日目が37個、そして5日目が19個であった。これらのタンパク質の等電点と分子量を基に、Arabidopsis thaliana及びRice antherのデータベースで相当するタンパク質を検索した結果、0日目では2個、2日目では7個、そして5日目では2個の相当するタンパク質が見出された。これらのタンパク質には、NADH-ubiquinone oxidoreductase 22.5kDa subunit, cytochrome C oxidase subunit vb precursor,そしてL-ascorbate peroxidaseが含まれており、何れもオキシダティブバーストに関与するタンパク質である。また、IO-B2株感染の場合にも、これらのオキシダティブバーストに関与するタンパク質が、データベース検索で見つかっている。従って、カバノアナタケIO-∪1株及びIO-B2株の感染のどちらの場合においても、シラカンバ幼植物体内で防御反応としてオキシダティブバーストが生じていることが考えられる。尚、本研究の成果は、日本農芸化学会2004年度大会で発表する予定である。