癌腫病菌カバノアナタケに対するシラカンバの感染特異的タンパク質の網羅的解析

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15580119
• Research Institution: Utsunomiya University
• Principal Investigator: 横田 信三 宇都宮大学, 農学部, 助教授 (60210613)
• Keywords: カバノアナタケ / シラカンバ / 菌感染特異的タンパク質 / プロテオーム / 樹病 / 二次元電気泳動 / オキシダティブバースト / 宿主特異的抵抗性

Research Abstract

本研究では、カバノアナタケIO-U1株の感染によって、シラカンバ幼植物体内に生成する感染特異的タンパクを検出し、データベースを基に検出されたタンパク質の推定を行った。特に、昨年度行った菌接種後0,2,5日目以外のサンプルの解析を行った。また、新しい二次元電気泳動用画像解析ソフトウェアを用いて、昨年度のIO-U1株及びIO-B2株のデータを再解析した。カバノアナタケIO-U1株を接種したシラカンバ幼植物体(処理区)、対照区1(無菌・無傷)及び対照区2(傷害)の各植物体を、菌接種後0〜7日間毎日採取した。これらを液体窒素で急速凍結後、粉砕し、タンパク質抽出緩衝液を用いて粗タンパク質溶液を調製した。得られた粗タンパク質溶液をメンブランフィルター濾過及びゲル濾過を行い、色素結合法によってタンパク質含量を測定した後、二次元電気泳動に供した。一次元目の泳動はIPGゲルを,そして二次元目の泳動はExcelGelSDSゲルを用いてそれぞれ行った。泳動後ゲルを銀染色し、乾燥後スキャナーでコンピューターにその画像を取り込み、二次元電気泳動画像解析ソフトウエアImageMaster 2D Platinumを用いて画像解析を行った。その結果、IO-U1株感染特異的タンパク質の総数は、0〜7日目でそれぞれ、125、79、111、69、96、138、86、163個であった。これらのタンパク質の等電点と分子量を基に、Arabidopsis thaliana、Rice anther及びMedicago truncatulaのデータベースで相当するタンパク質を検索した。その結果、オキシダティブバーストに関与するタンパク質として炭酸脱水酵素、NADH酸化還元酵素、シトクロムCオキシダーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、L-アスコルビン酸ペルオキシダーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼが相当するものとして見出された。また、その他のタンパク質としてPR10-1、カフェオイル-CoA O-メチルトランスフェラーゼ、カルコン-フラボノンイソメラーゼ、熱ショック70kDaタンパク質、グリセルアレデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、20Sプロテアソーム及びカルレティキュリンが検出された。IO-U1株の場合、オキシダティブバーストに関与するタンパク質が多くの日数で認められた。またIO-B2株の場合にも、オキシダティブバーストに関与するタンパク質が見出された。従って、カバノアナタケIO-U1株及びIO-B2株の感染のどちらの場合においても、菌感染一週間以内では、シラカンバ幼植物体内の主な防御反応としてオキシダティブバーストが生じていることが考えられる。尚、本研究の成果は、第55回日本木材学会大会で発表した。