森林性甲虫類の持つ植物細胞壁多糖類資化性共生微生物の分子生態学的解析

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15580136
• Research Institution: Nihon University Junior College
• Principal Investigator: 安齋 寛 日本大学短期大学部, 農学科, 教授 (70168029)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩田 隆太郎 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (90213298) ; 砂入 道夫 日本大学, 生物資源科学部, 助教授 (80196906)
• Keywords: 森林性甲虫 / カミキリムシ / 腸内微生物叢 / 16S rDNA / ミトコンドリアCOI遺伝子 / ルリボシカミキリ

Research Abstract

1.森林性鞘翅目甲虫の採集と飼育:食性の異なるカミキリムシの幼虫と成虫を11種入手し、飼育可能な幼虫は成虫を得るために一部の飼育を継続した。カブトムシの幼虫については、腐葉土、カブトムシ飼育用チップなど数種を飼料とし、各飼料ごとに数十個体を継続して飼育し、実験に使用した。
2.カミキリムシ幼虫の種同定:同一種と推定された複数個体の体組織からDNAを抽出し、PCR法を用いてミトコンドリアCOI遺伝子を増幅し、その配列を解析、比較して、同種か否かを判断した。
3.カミキリムシ幼虫腸管内微生物叢:アルコール漬けで冷凍保存した幼虫を解剖して消化管を取り出し、消化管内容物と消化管壁に分離し、それぞれからDNAを抽出し、16S rDNAの増幅を試みた。しかし、分析に供したいずれの種においても、消化管内容物から16S rDNAを増幅することは困難であった。
4.カブトムシ幼虫の腸管内生理条件の測定:カブトムシ幼虫の腸管を取り出し、口から肛門まで、腸管の経路に従って細分し、その腸管内pHと多糖分解酵素活性を測定した。その結果、腸管内はアルカリ性であり、部位によりpHに勾配があること、また、多糖分解酵素活性に関しても、勾配があることが示された。
5.カブトムシ幼虫腸内微生物叢:腸管内容物を希釈し、寒天平板培地で培養してたところ、好気的条件下では中性とアルカリ性で検出される細菌の種類が大きく異なることが示された。また、嫌気的条件で培養した結果、主要な細菌種は7つの属に分類された。さらに、消化管内容物からDNAを抽出し、16S rDNAを増幅し、PCR-DGGE法により解析したところ、腸管の部位により細菌叢の異なることが示された。