| Research Abstract |
GPIアンカー型タンパク質は,リン酸エタノールアミンを介してトリマンノース,グルコサミン,及びボスファチジルイノシトールが結合した膜タンパク質で,脳・神経系では,神経網形成などにおいて重要な役割を担っていると考えられている.GPIアンカー型タンパク質には複数のN結合型糖鎖が付加し,発生や成長に伴って変化することが示唆されているが,膜タンパク質のため精製が難しいことや,分子構造が複雑であることなどから,糖鎖構造が明らかにされているタンパク質は少ない.そこで昨年度は,電気泳動で分離したゲル内GPIアンカー型タンパク質から,ゲル内PNGase F消化によりN-結合型糖鎖を遊離させ,LC/MS^nを用いて糖鎖構造を解析する方法を開発し,GPIアンカー型タンパク質の一つであるラット脳由来Thy-1の糖鎖構造を明らかにした.Thy-1には3箇所のN結合型糖鎖結合可能部位が存在する.そこで本年度は,LC/MS^nを利用して独自に見出した糖ペプチド解析法を用いて,Thy-1の部位特異的糖鎖構造を明らかにした.また,本糖ペプチド解析法をGPIアンカー型タンパク質であるLAMP, OBCAM, NTM, kilonの部位特異的糖鎖構造解析に応用した.
生後3週間のラットの脳からGPIアンカー部分を切り離した可溶性のタンパク質部分を回収してSDS-PAGEを行い,20-25kDaのバンドにThy-1,また,45-85kDaのバンドにLAMP, OBCAM, NTM,及びkilonが泳動されていることを確認した.まず,20-25kDaのバンドから1%SDSを用いてThy-1を抽出し,トリプシンで消化した後,LC/MS^nを行い,Asn23及び98には高マンノース型糖鎖,混成型,及び2本鎖を中心とした複合型糖鎖,またAsn74にはフコシル複合型糖鎖が主に結合していることを明らかにした.つぎに,45-80kDaのバンドからLAMP, OBCAM, NTM,及びkilonをまとめて抽出した後,4つのタンパク質のトリプシン消化物混合物のLC/MS^nを行い,タンパク質毎の部位特異的糖鎖構造を明らかにした.この4つのタンパク質の糖鎖付加は類似しており,N末側には共通して高マンノース型糖鎖,また,C末にはルイス型糖鎖が集中して結合していることが明らかとなった.
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