2003 Fiscal Year Annual Research Report
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15590108
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
西川 諭 独立行政法人産業技術総合研究所, 生物機能工学研究部門, 主任研究員 (60357704)
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| Keywords | アプタマー / C型肝炎ウイルス / NS3プロテアーゼ / IRES |
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| Research Abstract |
1)アプタマーのインビボ活性評価系の開発
NS3プロテアーゼに対するアプタマーのインビボでの阻害効果を定量的、かつ鋭敏に測定できる系として、Green Fluorescent Protein(GFP)を利用したFRET測定法を開発した。このシステムにより、G9アプタマー(RNA)の直接導入ならびにG9アプタマー発現ベクターの導入による細胞内での転写発現(間接導入法)を検討し、アプタマーの効果を検証した。(Combi.Chem.High Throghput Screening発表)
2)HDVリボザイムを利用した抗HCVプロテアーゼアプタマーのタンデムリピート発現プラスミドの構築
HDVリボザイムのステムIV領域は可変であるので、ここにHCVNS3プロテアーゼに対するG9アプタマーを挿入したHDV-G9アプタマーを作成した。これによりRNAアプタマーの形がコンパクトとなり、細胞内での安定化を図れる。さらにそのユニットをくり返した発現ベクターを作成し、一度の導入で大量発現を目指した。直接導入の時とおなじく、基質、酵素各発現プラスミドとともにコトランスフェクトし、アプタマーの阻害効果を判定した。アプタマー遺伝子を4回繰り返すことにより、阻害効果を60%まで上昇できることを見出した。(Nucleic Acids Res.発表)
3)HCV IRESに特異的な新規アプタマーの創出
HCV IRESは亜種ウイルス間で保存性が高く、また特有の二次構造を持つので、この領域に対してどのような構造を持つRANアプタマーが得られるか、またそれを用いてHCV mRNAの転写阻害を行えるか否かを検証するため、インビトロ法により抗IRESアプタマーを創出した。IRESのドメインII領域に対してのRNAアプタマーはループ・ループ間のKissing interactionにより結合していることを明らかにした。IRESからのインビトロ翻訳に対する阻害効果はあまり見られず、ドメインII領域は突き出た構造をしているものの、機能的にはあまり重要でないと考えられた。(J.Biochem.発表)
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Research Products
(6 results)
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[Publications] N.Kakiuchi, S.Nishikawa (CA)他3名: "Detection of RNA aptamer inhibition on HCV serine protease in living cells using fluorescent protein substrates."Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 6. 155-160 (2003)
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[Publications] K.Kikuchi, S.Nishikawa (CA)他5名: "RNA aptamers targeted to domain II of hepatitis C virus IRES that bind to its apical loop region."J.Biochem.. 133. 263-270 (2003)
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[Publications] S.Sekiya, S.Nishikawa (CA)他2名: "Structure/function analysis of an RNA aptamer for hepatitis C v irusNS3 protease."J.Biochem.. 133. 351-359 (2003)
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[Publications] F.Nishikawa, S.Nishikawa (CA)他4名: "Inhibition of HCV NS3 protease by RNA aptamers in cells."Nucleic Acids Research. 31. 1935-1943 (2003)
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[Publications] S.Nishikawa(筆頭, CA)他2名: "In vitro selection of RNA aptamers against HCV-NS3 helicase and their structural similarity with 3'(+) UTR of HCV."Nucleic Acids Res. Supplement. #3. 241-242 (2003)
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[Publications] K.Kikuchi, S.Nishikawa(CA)他5名: "Structure-inhibition analysis of RNA aptamers that bind to HCV IRES."Nucleic Acids Rest.Supplement. #3. 291-292 (2003)
