2003 Fiscal Year Annual Research Report
細包膜上でのt-PA受容体の発現とその生理学的意義の検討
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15590198
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| Research Institution | Kinki University |
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Principal Investigator |
松尾 理 近畿大学, 医学部, 教授 (40030879)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡田 清孝 近畿大学, 医学部, 助手 (20185432)
上嶋 繁 近畿大学, 医学部, 助教授 (30193791)
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| Keywords | 血液線溶系 / 血管内皮細胞 / 組織性プラスミノーゲンアクチベータ(t-PA) / t-PA受容体 / 遺伝子組換え |
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| Research Abstract |
t-PAレセプター(t-PA receptor;t-PAR)は、組織性プラスミノーゲンアクチベータ(tissue-type Plasminogen activator;t-PA)に対する受容体である。血管内での線溶活性にはt-PAだけでなく、t-PARもその制御に極めて重要であると考えられる。本研究では、血管内での線溶活性の制御機構におけるt-PARの生理学的役割および意義をrecombinant t-PAR(rt-PAR)とt-PAとの相互作用から解析するとともに、細胞膜表面に発現させたt-PARの生理学的意義について検討する。
本年度は、血管内皮細胞が発現するt-PARのアミノ酸配列をコードするcDNA断片をPCR法により増幅し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(glutathione S-transferase;GST)を有するタンパク質発現ベクター(pGEX-1λT)に組込んだ。t-PARタンパク質は大腸菌(BL21)において、N末端にGSTを結合した融合タンパク質として発現させた。発現ベクターにはトロンビン処理によってGSTを遊離させるArg-Glyをコードする塩基配列が含まれている。融合タンパク質はグルタチオンセファロースを用いて精製し、トロンビン処理することでGSTを遊離させた。精製の解析はSDS-PAGEを用いて行った。その結果、IPTGによりinductionした大腸菌の溶解液に融合タンパク質が存在することが確認された。また精製したt-PARはSDS-PAGE後PVDF膜に転写し、western blot法により目的のタンパク質であることが確認された。融合タンパク質のトロンビン処理によって生じたGSTはアミノ酸配列解析により同定されたので、融合タンパク質はGSTとt-PARに分離していると考えられる。さらにこのt-PARがt-PAと相互作用するか、現在検討している。
次年度は、t-PARのアミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入して変異体を作製し、t-PAに対するt-PARの結合部位など、t-PARの構造および機能解析を行う。さらに、t-PARcDNAを血管内皮細胞あるいはCHO細胞の細胞膜上に発現させてt-PARの細胞上での機能を解析する。
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Research Products
(5 results)
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[Publications] Hiroyuki Matsuno: "Lack of α_2-antiplasmin promotes re-endothelialization via over-release of VEGF after vascular injury in mice"Blood. 102・10. 3621-3628 (2003)
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[Publications] Makoto Akao: "Cellular density regulation of plasminogen gene expression in mouse hepatocytes"Life Sciences. 72・15. 1695-1704 (2003)
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[Publications] Hiroyuki Matsuno: "α_2-antiplasmin plays a significant role in acute pulmonary"J Thromb Haemost. 1・8. 1734-1739 (2003)
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[Publications] Kiyotaka Okada: "The regulation of liver regeneration by the plasmin/α_2-antiplasmin system"J Hepatology. 40・1. 110-116 (2004)
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[Publications] Shigeru Ueshima: "Growth inhibition of vascular smooth muscle cells derived from urokinase receptor (u-PAR)-deficient mice in the presence of carcinoma cells"Thromb Res. (in press). (2004)
