2003 Fiscal Year Annual Research Report

尿酸トランスポーターに結合するPDZK1による尿酸輸送機能調節メカニズム

Research Project

Project/Area Number	15590233
Research Institution	Kyorin University
Principal Investigator	安西尚彦杏林大学, 医学部, 助手 (70276054)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	横山宏和杏林大学, 医学部, 助手 (60360103) 入部雄司杏林大学, 医学部, 助手 (20348618) 金井好克杏林大学, 医学部, 教授 (60204533)
Keywords	酵母Two-hybrid法 / 尿酸トランスポーター / PDZタンパク質 / 共免疫沈降法 / GSTプルダウンアッセイ / 近位尿細管
Research Abstract	我々は昨年度までに酵母Two-hybrid法を用いて腎臓尿酸トランスポーターURAT1の細胞内結合タンパク質PDZK1を同定し、部位指定突然変異導入法を用いた解析により、両タンパク質の結合はURAT1のC末端側アミノ酸配列(PDZモチーフ)とPDZK1の第1、第2および第4PDZドメインとの間で生じること、また哺乳類培養細胞HEK293へのURAT1・PDZK1共遺伝子導入により、URAT1を介する尿酸輸送が増加することを明らかにしていた。本年度の科学研究費補助金助成により、以下の新たな知見が見出された。 1)URAT1とPDZK1の桔合が、共免疫沈降法やGSTプルダウンアッセイ等の生化学的手法によっても確認され、酵母Two-hybrid法の結果を裏付ける証明が得られた。 2)URAT1発現HEK293細胞にPDZK1遺伝子導入を行い、尿酸輸送キネティクス解析を行った結果、PDZK1共発現はKmを変えることなく、Vmaxのみを変化させることが明らかになり、URAT1のタンパク質構造の変化を伴わない輸送機能の活性化ないし形質膜上でのタンパク質発現量の増加ないし安定化といった効果をPDZK1がもたらしていることが強く示唆された。 3)ヒト腎臓組織連続切片に対し、抗ヒトURAT1抗体および抗ヒトPDZK1抗体を用いて免疫組織染色を行ったところ、腎近位尿細管管腔側膜に両タンパク質の局在を認めた。さらにヒト腎臓由来タンパク質に対し、上記抗体を用いて共免疫沈降実験を行った所、URAT1とPDZK1の結合を確認することができた。この結果は実際の腎臓においてURAT1とPDZK1の結合が存在し、生理学的な重要性があることの証明となった。次年度は以上の結果をもとに両タンパク質の相互作用の実態をさらに明らかにするべく、1)共焦点レーザー顕微鏡を用いたGFP融合URAT1タンパク質の局在解明、2)表面プラズモン共鳴法を用いた両タンパク質結合の親和性の解析、3)表面ビオチン化法による細胞膜上URAT1タンパク質発現量のPDZK1による影響、の点についての検討を行う予定である。

Research Products

(7 results)

All Other

All Publications (7 results)

[Publications] Takeshi Sakata: "Novel single nucleotide polymorphisms of organic cation transporter 1 (SLC22A1) affecting transport functions"Biochem Biophys Res Commun. 313・3. 789-793 (2004)
[Publications] Toshihisa Ishikawa: "The genetic polymorphism of drug transporters : functional analysis approaches."Pharmacogenomics. 5・1. 67-99 (2004)
[Publications] Babu Ellapan: "Identification of a novel system L amino acid transporter structurally distinct from heterodimeric amino acid transporters"J Biol Chem. 278・44. 43838-43845 (2003)
[Publications] Promsuk Jutabha: "Identification of a novel voltage-driven organic anion transporter present at apical membrane of renal proximal tubule"J Biol Chem. 278・30. 27930-27938 (2003)
[Publications] 安西尚彦: "Yeast Two-hybrid法によるイオンチャネルの細胞内調節因子の同定法"日本薬理学会誌. 122・4. 331-337 (2003)
[Publications] 安西尚彦: "酵母Two-hybrid法によるイオンチャネル・トランスポーター細胞内結合タンパク質の同定"腎と透析. 55・2. 369-375 (2003)
[Publications] 安西尚彦: "Annual Review腎臓2004"伊藤克己, 浅野泰, 遠藤仁, 御手洗哲也, 東原英二. 251 (2004)

2003 Fiscal Year Annual Research Report

尿酸トランスポーターに結合するPDZK1による尿酸輸送機能調節メカニズム

Principal Investigator

安西 尚彦 杏林大学, 医学部, 助手 (70276054)

Research Products

[Publications] Takeshi Sakata: "Novel single nucleotide polymorphisms of organic cation transporter 1 (SLC22A1) affecting transport functions"Biochem Biophys Res Commun. 313・3. 789-793 (2004)

[Publications] Toshihisa Ishikawa: "The genetic polymorphism of drug transporters : functional analysis approaches."Pharmacogenomics. 5・1. 67-99 (2004)

[Publications] Babu Ellapan: "Identification of a novel system L amino acid transporter structurally distinct from heterodimeric amino acid transporters"J Biol Chem. 278・44. 43838-43845 (2003)

[Publications] Promsuk Jutabha: "Identification of a novel voltage-driven organic anion transporter present at apical membrane of renal proximal tubule"J Biol Chem. 278・30. 27930-27938 (2003)

[Publications] 安西尚彦: "Yeast Two-hybrid法によるイオンチャネルの細胞内調節因子の同定法"日本薬理学会誌. 122・4. 331-337 (2003)

[Publications] 安西尚彦: "酵母Two-hybrid法によるイオンチャネル・トランスポーター細胞内結合タンパク質の同定"腎と透析. 55・2. 369-375 (2003)

[Publications] 安西尚彦: "Annual Review腎臓2004"伊藤克己, 浅野 泰, 遠藤 仁, 御手洗哲也, 東原英二. 251 (2004)

安西尚彦杏林大学, 医学部, 助手 (70276054)

[Publications] 安西尚彦: "Annual Review腎臓2004"伊藤克己, 浅野泰, 遠藤仁, 御手洗哲也, 東原英二. 251 (2004)