ベントDNAによる低温依存性転写促進機構の構造生物学的研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15590404
• Research Institution: Okayama University of Science
• Principal Investigator: 片山 誠一 岡山理科大学, 理学部, 講師 (70169473)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松下 治 香川大学, 医学部, 助教授 (00209537)
• Keywords: Clostridium perfringens / ホスホリパーゼC / 転写調節 / phased A-tracts / RNAポリメラーゼ / αサブユニット / 共結晶

Research Abstract

ウェルシユ菌ホスホリパーゼC遺伝子のプロモーター上流に存在する3つのphased A-tractsがRNAポリメラーゼ(RNAP)のαサブユニットのC末端ドメイン(αCTD)とどのように結合するのか明らかにするためには、phased A-tractsとαCTDの共結晶を作成し、構造生物学的な解析を進める必要がある。平成15年度は、αCTDとαサブユニットの大量精製系の確立を試みた。
まずウェルシュ菌RNAPαサブユニット(α,315aa)をコードするrpoA遺伝子とphased A-tractsに結合するC末端ドメイン(αCTD,79aa)のみをコードする遺伝子を大腸菌pET発現系ベクターのpET16bに挿入した。これによりHis-tagをN末端に持つαサブユニットとαCTDを大腸菌を用いて大量合成することが可能となった。実際にそれぞれの蛋白質を大量合成させ、His-tagを利用して精製したところ、1リットル培養液当たり、His-tagged αサブユニットは、27mg、His-tagged αCTDは、7mg程度得られた。標品中には、いくつかの別のタンパクが混在していたため、Mono Qでさらに精製したところ、His-tagged αサブユニット、His-tagged αCTDは結晶化に耐えうるほど精製できたが、最終精製量は、His-tagged αサブユニットは3.3mg、His-tagged αCTDは、2.0mgと少なかった。今後、大量精製法の改良を加える必要がある。そしてphased A-tracts DNA断片(33bp)と25℃で結合させて、その結合体が共結晶化できるほど、安定した構造を保っているか調べ、共結晶化を共同研究者であるJoshua Sakon博士ら(米国:University of Arkansas)に依頼する予定である。

Research Products

• [Publications] Kaji, M., Katayama, S., et al.: "A novel type of DNA curvature present in a Clostridium perfringens ferredoxin gene : characterization and role in gene expression"Microbiology. 149・11. 3083-3091 (2003)