2003 Fiscal Year Annual Research Report
GFP-ミオシン融合タンパクの細胞内発現とその臨床的応用
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15590493
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
田窪 孝行 大阪市立大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (60163359)
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| Keywords | GFP-myosin / actin / MYH9 / motor protein |
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| Research Abstract |
1.ミオシンII遺伝子(MYH9)の構築
ヒト肝癌細胞であるHepG2よりmRNAを抽出し、RT-PCR法にてcDNAを得た。ミオシンII遺伝子の鎖長は長く、Gc Richな配列を含むため(5886bp)、一回のPCRで全長を増幅させることはできなかった。そこで構造遺伝子中に存在するEco RIでつなぐ設計を行い、2つの断片に分けてPCRを行っている。各断片をそれぞれミオシンII遺伝子(MYH9; Muosin Heavy Polypeptide 9)の5'末端側からFragmentA, Bとし、制限酵素サイトの設計およびクローニングベクターpUC118の選定を行った。実際に2つの断片に分けることによりPCRで各断片の増幅が可能となった。PCRによる断片の増幅をアガロースゲル電気泳動により確認している。それぞれの断片をクローニングベクターに組み込んだ後、ライゲーションにてミオシンII遺伝子の構築を行った。ミオシンはN末端にアクチンと結合するための頭部モータードメインを持っているため融合タンパクを作製した時に、EGFPが立体障害を起こしてアクチンと結合できなくなる可能性を回避するために、ミオシンのC末端とEGFPのN末端を融合させる構造をとっている。得られた遺伝子は制限酵素処理をしてクローニングベクターpUC118から発現導入ベクターであるpGEFPへ導入した。構築完成遺伝子(GFP-MYH9)は増幅後塩化セシウムによる密度勾配遠心操作で純化し、スーパーコイル状態のものだけを精製分離して細胞への導入実験に使用した。
2.ミオシンII遺伝子(MYH9)の細胞への導入
1.で精製したスーパーコイル状態pGEFP-MYH9を研究が行いやすいヒト子宮頸部癌細胞株HeLaへ導入することによりミオシン発現を確認した。
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