動脈硬化症の危険因子ADMAの微量検出・定量法の開発

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15590494
• Research Institution: Okayama Prefectural University
• Principal Investigator: 木本 眞順美 岡山県立大学, 保健福祉学部, 教授 (40108866)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 辻 英明 岡山県立大学, 保健福祉学部, 教授 (20093875) ; 山下 広美 岡山県立大学, 保健福祉学部, 講師 (70254563) ; 比江森 美樹 岡山県立大学, 保健福祉学部, 助手 (80326412) ; 松岡 秀洋 久留米大学, 医学部, 講師 (80248393)
• Keywords: Nitric oxide / メチル化アルギニン / ADMA / DDAH / 心臓血管動脈硬化症 / 組み換え型ヒトDDAH / モノクローナル抗体 / ハプテン抗原

Research Abstract

我々は生体内に存在するADMAがNO産生の内因性阻害剤として働き、これを代謝する酵素であるDDAHがNO産生制御系の鍵酵素となるという新説を導きだした。この事実から、動脈硬化症をはじめとするNO産生障害が原因となる病態の発症・進展のメカニズムを明らかにし、新しい予防・治療の概念を産み出すためにも生体内のADMA動態を詳細に評価しうるシステムの構築が重要な課題であると考えられる。このような観点に立って、本研究においては、ADMAの特異的かつ微量検出・定量法の開発を計画した。現在、二つの方法の開発を考えている。一つは、DDAHの酵素反応を利用したシステム(システム1)であり、他の一つはADMAに対するモノクローナル抗体を作製してELISAによる定量系を確立(システム2)することである。平成16年度は、初年度に作製した最も有効なモノクローナル抗体(mAb)を実際の定量に応用できるシステムの構築に専念した。すなわち、主としてシステム2の研究計画に沿って実験を進めた。最終的に3種のmAb(2G3,3C12,3E11)が得られ、3C12と3E11は、アルギニン誘導体のうち、ADMAに対する特異性に優れていた。また、これらの抗体は遊離型ADMAよりアセチル誘導体、さらにはMBSアシル化ADMAに対して親和性が高く、生体試料のMBS化は高感度測定系の構築を可能にすることが示された。そこで、3C12を固定化抗体とし、ADMA-MBS-β-galactosidaseを反応抗原とする競合ELISA測定系を構築した。反応活性はgalactosidase活性の蛍光分析法による測定値を用いた。本法による最小測定限界値はアセチルADMAおよびMBSアシル化ADMAに関して、それぞれ1μMおよび1nMオーダーであった。MBSによりアシル誘導体化したアルギニンを含む他の各種アミノ酸は0.1Mでさえも測定範囲には入らなかった。以上の結果から、生体試料に共存する過大量のアミノ酸は本測定系によるADMAの定量性を妨害することはないと考えられた。そこで、本法を用いて健康人の血漿ADMAを定量した結果、0.60μMの値を得た。これはHPLCを用いた測定値とよく相関しており、本研究の最終目標である臨床検査法として適することが示された。今後、さらに各種病態における検体数を増やし、本法の有用性を確認する。