2003 Fiscal Year Annual Research Report
クローニング分析による混合斑痕からのミトコンドリアDNA解析法に関する研究
Project/Area Number |
15590580
|
Research Institution | 宮崎医科大学 |
Principal Investigator |
瀬尾 泰久 宮崎大学, 医学部, 助教授 (80187830)
|
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柿崎 英二 宮崎大学, 医学部, 助手 (70284833)
高見 恭成 宮崎大学, 医学部, 助教授 (80236356)
湯川 修弘 宮崎大学, 医学部, 教授 (30240154)
|
Keywords | 個人識別 / DNA多型 / ミトコンドリア / mtDNA / シークエンス / クローニング / PCR |
Research Abstract |
ミトコンドリアDNA(mtDNA)は環状2本鎖構造であり、その非コード領域には多数の点突然変異を有しているため、個人の識別に極めて有用である。しかもmtDNAは、1細胞中に数百から時には数千コピーも存在するため、極微量な試料や陳旧なものからでも、PCR法とダイレクトシークエンス法を組み合わせた個人識別が可能である。また、相同染色体よりなる核DNAとは異なり、mtDNAのPCR産物は通常単一なmtDNA配列に由来する。従って、STR解析などでは分別が困難な混合斑痕の場合、mtDNAのPCR産物を大腸菌にクローニングすることによって、混入しているものを容易に識別することができる。本年度は、先ず、混合斑痕から抽出したDNAを用いて通常通りmtDNA型判定を行い、そのPCR産物を大腸菌にクローニングした後、コロニーPCR法とダイレクトシークエンス法を使って混入したmtDNA型判定が可能か否かについて検討した。その結果、混合斑痕を通常のmtDNA型判定法で判定した場合、個人間で変異の見られる箇所に重複したピークが複数観察され、シークエンスのエレクトロフェログラムを詳細に読み取ることによって混合斑痕か否かの鑑別が可能であったが、それがどのようなタイプを示すのか、また何人に由来するのかなどの識別は困難であった。次いで、得られたPCR産物をT-ベクターに組み込み、大腸菌にクローニングして、任意に約20クローンを選びシークエンス解析を行うと、混入したmtDNAのタイプと由来する人数の識別が可能であった。しかし、15〜20%のクローンでは、PCR増幅時に起こったと考えられるエラー配列を有していた。今後は、エラ率の少ないTaqポリメラーゼやPCRサイクル数などについての検討を行うつもりである。
|