2004 Fiscal Year Annual Research Report
再会合消化法による一塩基多型(SNPs)の新しいハイスループット検出法の開発
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15590592
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| Research Institution | Kansai Medical University |
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Principal Investigator |
赤根 敦 関西医科大学, 医学部, 教授 (70202520)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 学 関西医科大学, 医学部, 講師 (20122004)
沖井 裕 関西医科大学, 医学部, 助手 (20121915)
吉村 澄孝 関西医科大学, 医学部, 助手 (70167005)
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| Keywords | Se式血液型 / 温度勾配ゲル電気泳動法 / ヘテロ二重鎖 / 対立遺伝子 / PCR / 一塩基多型(SNP) / ABO式血液型 / 再会合 |
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| Research Abstract |
継続して行っているSe式血液型遺伝子の温度勾配電気泳動法による一塩基多型(SNP)解析について,日本人に代表的な対立遺伝子であるSe1,Se2,sejおよびse^<fus>の分析条件を検討した。ヘテロ接合体試料では通常のPCR反応を行うだけでヘテロ二重鎖が十分量形成され,再会合のための特別の手順を設ける必要がなかった。ヘテロ接合体試料では温度勾配電気泳動法で遺伝子型の識別が可能で,増幅産物中の塩基置換の個数に相関してバンドの数が増えていった。ただしホモ接合体試料の場合には遺伝子型にかかわらず常にバンドは同じ断片長の1本しか検出されないため,特定の対立遺伝子試料と混合して再会合反応(95℃で加熱後,50℃で保存)を行う必要があった。以上については英文論文にまとめて投稿中で,3月中に受理される見通しである。
次にミスマッチ部分の消化方法について検討した。論文に報告のあるジオキサンを添加したS1 nucleaseによる消化法では,報告と異なりミスマッチ部分で切断されないことが判明した。特にS1 nuclease消化について,温度条件その他を種々検討したが,酵素作用が弱いと切断されず,強くするとバンド全体が消化されて不明瞭となった。さらに化学的消化法として,四酸化オスミウムや過マンガン酸カリウムによる特定のミスマッチ塩基の修飾・切断法について検討したが,良好な結果は得られなかった。ミスマッチ部分消化方法については,これまでに報告されているその他の方法も実施が困難と予想され,新たな方法の開発を検討している。
温度勾配電気泳動法自体は遺伝子型判定に適していたため,さらにABO式血液型遺伝子の分析への応用を始めた。エクソン6とエクソン7とを個別に増幅し分析したところ,良好に遺伝子型が判定できた。ただし塩基置換が多いヘテロ二重鎖はバンドが不鮮明になることが判明した。現在学会発表の準備中である。
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