エンドスタチンcDNAによる骨髄細胞を標的とした肝細胞癌に対する遺伝子治療の試み

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15590700
• Research Institution: Kurume University
• Principal Investigator: 鳥村 拓司 久留米大学, 医学部, 助教授 (60197986)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上野 隆登 久留米大学, 先端癌治療研究センター, 教授 (70176618) ; 岡村 孝 久留米大学, 医学部, 助教授 (30136436) ; 谷口 英太郎 久留米大学, 医学部, 助手 (50341318)
• Keywords: 肝細胞癌 / 遺伝子治療 / 血管新生抑制 / 血管内皮前駆細胞 / エンドスタチン / K1-5 / レトロウイルス

Research Abstract

平成16年度はまず、pBluescript SK(+)/SSベクターに組み込まれていたマウスエンドスタチンのcDNAとpProEXHTベクターに組み込まれていたヒトKringke1-5のcDNAを制限酵素にて切り出した後、キットを用いてレトロウイルスベクターの作成を試みた。ヒトKringke1-5のcDNAをレトロウイルスベクターに組み込むことには成功したが、マウスエンドスタチンのcDNAの組み込みは現在も継続中である。ヒトKringke1-5のcDNAを組み込んだレトロウイルスベクターを293T細胞に感染させ、Amphovirusを作成し、さらにこのウイルスをより感染力の強いGALVvirusに変換した。このウイルスをBalbCマウスの大腿骨より採取した骨髄細胞にレトロネクチンをコートした培養皿で6時間感染させた。さらに、この細胞を24時間培養しその培養液中に分泌されたKringle1-5蛋白をウェスタンブロットにて確認した。平成17年度はさらに、このウイルスをテトラサイクリン存在下で作用するようにしてマウスの骨髄細胞に感染させた後にレシピエントマウスにたいし骨髄移植する予定である。
担癌マウスにおいて血管内皮前駆細胞が正常なマウスに比べて変化しているか否かを検討するため、ヌードマウスの肝臓に肝癌細胞株(KYN-2)を接種し4週後に屠殺し骨髄中の血管内皮前駆細胞の数を正常マウスと比較した。その結果、担癌マウスでは優位に骨髄中の血管内皮前駆細胞が増加していた。
次に、実際に骨髄由来の細胞が肝癌組織の内皮細胞や平滑筋細胞に動員されているかを確かめるため、GFPトランスジェニックマウスであるB6C3F1B6C3F1-TgN(act-EGFP)OsbCX-FMO38マウスの大腿骨より採取した骨髄細胞を10×10^6個スキッドマウスに3.75GY放射線を照射した後尾錠脈から注入した。現在、移植したGFP発現骨髄細胞がレシピエントマウスの骨髄に生着していることを確認するため2ヶ月間経過観察中である。平成17年度は完成した骨髄移植マウスの肝臓に対して肝癌細胞を接種し実際に骨髄由来の細胞がどの程度肝癌組織内へ遊走してきているかを検討する予定である。