血管緊張と増殖制御機構の解明:蛋白質を無傷で細胞内導入する新たな方法の確立と応用

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15590758
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 平野 勝也 九州大学, 大学院・医学研究院, 講師 (80291516)
• Keywords: タンパク質 / 血管 / 平滑筋 / 内皮細胞 / 収縮 / 組換えDNA / 脱リン酸化酵素

Research Abstract

ヒト免疫不全ウイルスの転写因子Tatタンパク質に認められる細胞侵入性ペプチド(PTD)を用いて、タンパク質を無傷血管組織に導入することに成功した。ミオシン脱リン酸化酵素調節サブユニットMYPT1のN末端アミノ酸領域1-374をPTDとの融合タンパク質(TAT-MYPT1:1-374)として発現させた。ブタ冠動脈より作製した血管条片を、TAT-MYPT1:1-374で15分間処理すると、脱分極刺激が引き起こすミオシンリン酸化と発生張力が増大した。細胞質カルシウム濃度上昇は、未処理の場合と同程度であった。収縮増強作用は、5分処理から有意に認められた。また、収縮増強には、2-3μM濃を要した。タンパク質を除去すると、収縮増強作用は消失し、再びタンパク質で処理すると、初回と同程度の収縮増強を認めた。TATペプチド部分を除いたタンパク質MYPT1:1-374には、収縮増強作用を認めなかった。一方TATペプチドを結合させた緑色蛍光タンパク質(GFP)には、収縮増強作用を認めなかった。蛍光顕微鏡観察により、GFPが細胞内に取り込まれたことを確認した。収縮増強作用に必要な領域を決定するために、種々の領域を欠損する組換え体を作製した。TAT-MYPT1:1-296は、収縮増強作用を有していたが、TAT-MYPT1:1-374よりも減弱した。TAT-MYPT1:1-171、TAT-MYPT1:39-296、TAT-MYPT1:39-374、TAT-MYPT1:297-374には、収縮増強作用を認めなかった。免疫ブロット解析により、全てのTATタンパク質が血管細胞内に取り込まれたことが明らかとなった。すなわち、MYPT1領域1-296が、収縮増強に必要不可欠の最小領域であり、領域297-374は補助的作用を有することが明らかとなった。導入タンパク質は、内在性のミオシン脱リン酸化酵素活性に必要なMYPT1と触媒サブユニットとの相互作用を阻害することにより、酵素活性を抑制し、ミオシンリン酸化を増強して、収縮反応を増強したと考えられた。本研究により、PTDを用いたタンパク質細胞内導入法が、定量的、可逆的、迅速なタンパク質導入を可能とし、細胞膜を保ったままで、血管機能における種々のシグナルタンパク質の生理的役割を明らかにする上で、有効な方法であることが明らかとなった。

Research Products

• [Publications] Hirano K, Derkach DN, Hirano M, Nishimura J, Takahashi S, Kanaide H: "Transduction of the N-terminal fragments of MYPT1 enhances myofilament Ca^<2+> sensitivity in an intact coronary artery"Athersclerosis Thromb Vasc Biol. (印刷中). (2004)
• [Publications] Hirano K, Derkach DN, Hirano M, Nishimura J, Kanaide H: "Protein kinase network in the regulation of phosphorylation and dephosphorylation of smooth muscle myosin light chain"Mol Cell Biochem. 248. 105-114 (2003)
• [Publications] Hirano K, Zeng Y, Hirano M, Nishimura J, Kanaide H: "Sequence requirement for nuclear localization and growth inhibition of p27^<KiP1R> a degradation-resistant isoform of p27^<KiP1>"J Cell Biochem. 89. 191-202 (2003)
• [Publications] Maeda Y, Hirano K, Nishimura J, Sasaki T, Kanaide H: "Rho-kinase inhibitor inhibits both myosin phosphorylation-dependent and -independent enhancement of myofilament Ca^<2+> sensitivity in bovine middle cerebral artery"Br J Pharmacol. 140. 871-880 (2003)
• [Publications] Nakayama T, Hirano K, Shintani Y, Nishimura J, Nakatsuka A, Kuga H, Takahashi S, Kanaide H: "Unproductive cleavage and inactivation of protease-activated receptor-1 by trypsin in vascular endotheial cells"Br J Pharmacol. 138. 121-130 (2003)
• [Publications] Eto W, Hirano K, Hirano M, Nishimura J, Kanaide H: "Intracellular alkalinization induces Ca^<2+> influx via non-voltage-operated Ca^<2+> channels in the rat aortic smooth muscle cells"Cell Calcium. 34. 477-484 (2003)