レトロウイルス発現系を用いた「インスリン依存性糖輸送活性化」調節因子の同定

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15590945
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 柱本 満 愛媛大学, 医学部附属病院, 助手 (40346680)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大沼 裕 愛媛大学, 医学部, 助手 (00294794) ; 大澤 春彦 愛媛大学, 医学部, 助教授 (90294800) ; 牧野 英一 愛媛大学, 医学部, 教授 (50009578) ; 西田 亙 愛媛大学, 医学部附属病院, 助手 (80271089)
• Keywords: インスリン作用 / グルコース輸送 / 糖輸送担体 / GLUT4 / レトロウィルス発現系

Research Abstract

研究計画の概略は、(1)インスリン依存性GLUT4 translocation-incompetentな細胞に細胞外myc epitopeを付したGLUT4を発現させ、(2)この細胞にGLUT4 translocation-competentな3T3-L1脂肪細胞より調整したcDNA libraryをレトロウィルス発現系により感染させ、(3)単クローン化した細胞株をflow cytometryに供し、細胞外myc epitopeの蛍光標識を指標としてスクリーニングを行う。(4)細胞外標識の増加(すなわちGLUT4の細胞膜面への移動)の確認されたクローンを同定後、(5)調整したゲノムDNAをtemplateに、ベクター特異的塩基配列をprimerとしてPCRを行い、(6)cDNA libraryの感染によりintegrateされたcDNAをGLUT4 translocation惹起因子として同定する、というものである。
この内既に(1)〜(4)の段階が終了し、既に複数の陽性クローンが単離された。今後は(5)・(6)の計画に基づき、単離クローンを使用してintegrateされた遺伝子の同定を進めると同時に、さらに対象クローン数を増加させて(3)・(4)によるスクリーニングを継続する予定である。また、(5)・(6)により同定された遺伝子の機能、特にインスリン感受性糖輸送活性化への関与を検討する上で、先ず単離遺伝子を発現させた細胞を用いたassayを行う予定であるが、現時点で既に当該遺伝子が導入された単clone細胞株は樹立されている。これらを脂肪分化誘導後、インスリン依存性糖輸送活性化・GLUT4 translocationに関する各種細胞生物学的評価を行う。