2004 Fiscal Year Annual Research Report
レトロウイルス発現系を用いた「インスリン依存性糖輸送活性化」調節因子の同定
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15590945
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| Research Institution | EHIME UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
柱本 満 愛媛大学, 医学部附属病院, 助手 (40346680)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
牧野 英一 愛媛大学, 医学部, 教授 (50009578)
大澤 春彦 愛媛大学, 医学部, 助教授 (90294800)
大沼 裕 愛媛大学, 医学部, 助手 (00294794)
西田 亙 愛媛大学, 医学部附属病院, 助手 (80271089)
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| Keywords | インスリン作用 / グルコース輸送 / 糖輸送担体 / GLUT4 / レトロウィルス発現系 |
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| Research Abstract |
当初の研究計画は、(1)インスリン依存性GLUT4 translocation-incompetentな細胞に細胞外mycepitopeを付したGLUT4を発現させ、(2)この細胞にGLUT4 translocation-competentな3T3-L1脂肪細胞より調整したcDNA libraryをレトロウィルス発現系により感染させ、(3)単クローン化した細胞株をflow cytometryに供し、細胞外myc epitopeの蛍光標識を指標としてスクリーニングを行う。(4)細胞外標識の増加(すなわちGLUT4の細胞膜面への移動)の確認されたクローンを単離後、(5)同クローンより調整したゲノムDNAをtemplateに、ベクター特異的塩基配列をprimerとしてPCRを行い、(6)更に単離遺伝子を導入した細胞を用いた分子細胞生物学的解析により分子機能の確認を行い、integrateされたGLUT4 translocation惹起分子を同定する、というものである。
この内既に(1)〜(4)が終了し、複数の陽性クローンの単離に成功した。今後は(5)・(6)の計画に基づき、単離クローンを使用してintegrateされた遺伝子の同定及びその遺伝子の機能、特にインスリン感受性糖輸送活性化への関与を順次検討する予定である。
また当該研究期間中に、今回使用したflow cyometryを使用した方法のscreening効率及び精度を向上する目的で、異なるアプローチ、すなわち当初の研究計画でも用いた細胞表面蛍光標識を蛍光マイクロプレートリーダーで測定し、多数cloneの同時処理を可能とする検討を試みた。現段階で当初のscreening目的に耐える条件の設定に成功しており、今後この方法を併用して、更に多数doneの一層効率的なscreeningを継続する予定である。
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