2004 Fiscal Year Annual Research Report
コンディショナルノックアウトによる膵β細胞カルモデュリンキナーゼIIの機能解析
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15590949
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| Research Institution | KUMAMOTO UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
松本 和也 熊本大学, 医学部附属病院, 助手 (80346999)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮村 信博 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (40274716)
豊永 哲至 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 助手 (60295128)
荒木 栄一 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 教授 (10253733)
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| Keywords | 膵β細胞 / カルシウム / カルモデュリン / インスリン分泌 / プロモーター解析 / 阻害蛋白CaMKIIN |
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| Research Abstract |
我々は膵β細胞株MIN6細胞においてカルシウムカルモデュリン依存性蛋白質リン酸化酵素II(CaMKII)δサブユニットがインスリン分泌顆粒と同様の細胞内局在を示し、その過剰発現はインスリン分泌の基礎分泌およびグルコース応答性分泌を増加させることを報告した。本研究では膵β細胞におけるCaMKIIの機能を更に検討するため、膵β細胞特異的なCaMKIIδサブユニット欠損マウスを作製し、ラ氏島形成、インスリン合成・分泌能等に及ぼす影響を検討することを目的とした。
遺伝子改変動物作成のためLoxP、レポーター遺伝子(チミジンキナーゼ/ネオマイシン耐性遺伝子TK/neo)、ジフテリア毒素B遺伝子(DTB)の挿入部位として、イントロンに唯一の制限酵素部位Nae I、Sex AI、Pfl MIを本クローンに同定した。両端にNae I認識配列を付加したLox P断片(Nae I-Lox P-Nae I)を本クローンに挿入した。今後は同様の手法にてSex AI-Lox P-TK/neo-Lox P-Sex AI、Pfl MI-DTB-Pfl MI断片を挿入する予定である。更に近年ヒト及びラットにおいて報告されたCaMキナーゼIIの内在性阻害ペプチドcDNAをMIN6細胞株より単離した。阻害ペプチドcDNAを発現するアデノウイルスベクターを作成中であり、CaMキナーゼIIの機能解析に供する予定である。
また、C57/BL6マウスES細胞由来の遺伝子ライブラリーよりδサブユニット遺伝子を単離し、翻訳開始コドンを含む全長19kbのクローンを同定した。129系マウスゲノムとはイントロンの制限酵素部位が一部異なっていた。上流4.4kb全体及びその制限酵素断片を組込んだルシフェラーゼレポーター遺伝子を作成し、これをマウス神経芽腫・ラット神経膠腫ハイブリドーマ細胞NG108-15に導入し転写活性を確認した。DNA Transcription Factor Binding Site Searchソフトにてプロモータ領域にSRY、C/EBPβ、STAT2、CdxA、GATA-1、USF、CREBの結合部位とTATA、GCボックスを同定した。
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