表皮角化細胞の増殖・分化における変換機転因子の検討

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15591182
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 白方 裕司 愛媛大学, 医学部, 助手 (50226320)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山崎 研志 愛媛大学, 医学部, 助手 (40294798)
• Keywords: TOB / EGF / adenovirus vector / cross-induction / autocrine / knockout mouse / keratinocyte / serum free culture

Research Abstract

TOB (Transducer of Erb)はEGF受容体のErbBファミリーの一つであるErbB2に結合する物質として発見され、現在までに6個の構造の似た分子(TOB, TOB2, Btg1, Btg2, B1g3, Pc3b)が発見され、TOBファミリーとして知られている。TOBの特徴として、静止期細胞では活性化状態にあり、細胞周期によりその発現が変動し、EGF受容体が活性化されるとTOBの活性化状態が変動し、TOBの強制発現はサイクリンDの減少を引き起こす。本研究ではEGFファミリーを中心とした表皮角化細胞のautocrineおよびcross-induction機構にTOBがいかに関与しているかを検討するために以下の実験を行った。
ヒト表皮角化細胞がTOBを発現しているかについてヒト表皮角化細胞からRNAを抽出し、特異的プライマーを用いてRT-PCRを施行したところ、ヒト表皮角化細胞にはTOB分子が存在していることを確認した。さらにEGFの投与により表皮角化細胞内のTOB遺伝子の発現が変動するかについて検討を加えたところ、EGF刺激によりTOB mRNAは濃度依存性に増加した。このことより、ヒト表皮角化細胞においてTOBがEGF刺激により誘導されることはnegative-feedbackの可能性があることが示唆された。
さらに、EGF依存性細胞増殖におけるTOBの関与を検討する目的で、TOBアデノウィルスベクターを作製した。作製したアデノウィルスベクターはAx-TOB、Ax-TOB 3SA(常時活性型)、Ax-TOB 3SE(ドミナント・ネガティブタイプ)であり、大量増殖後に精製を行い、冷凍保存した。
TOBノックアウトマウスを用いたEGF依存性細胞増殖におけるTOBの関与を検討する目的で、ノックアウトマウスを飼育、交配し、次年度のマウスを用いた実験の準備を完了した。さらに、TOBノックアウトマウス表皮細胞の培養系での検討に備えて、TOBノックアウトマウス新生児表皮を剥離し、無血清培養法にて角化細胞を培養、継代を行い適宜保存した。

Research Products

• [Publications] Yahata Y, Shirakata Y, Tokumaru S, Yamasaki K, Sayama K, et al.: "Nuclear translocation of phosphorylated STAT3 is essential for VEGF-induced human dermal microvascular endothelial cell migration and tube formation"The Journal of Biological Chemistry. 278. 40026-40031 (2003)
• [Publications] Shirakata Y, Tamai K, Nakaoka H, Tokumaru S, Sayama K, et al.: "Severe Palmo-plantar Hyperkeratosis in Koebner Epidermolysis Bullosa Simplex"The Journal of Dermatology. 30. 135-140 (2003)
• [Publications] Tsuda T, Thoyama M, Yamasaki K, Shirakata Y, Yahata Y, Sayama K et al.: "Lack of evidence for TARC/CCL17 production by normal human keratinocytes in vitro"The Journal of Dermatological Science. 31. 37-42 (2003)
• [Publications] Hanakawa Y, Tokumaru S, Shirakata Y, Sayama K, et al.: "SOCS1/JAB and SOCS3/CIS3 negatively regulate the STATs signaling pathway in normal human epidermal keratinocytes"The Journal of Investigative Dermatology. 120. 571-580 (2003)
• [Publications] Yamasaki K, Toriu N, Hanakawa Y, Shirakata Y, Sayama K, et al.: "Keratinocyte growth inhibition by high-dose epidermal growth factor is mediated by transforming growth factorβ autoinduction : A negative feedback mechanism for keratinocyte grrowth"The Journal of Investigative Dermatology. 120. 1030-1037 (2003)
• [Publications] Shirakata Y, Tokumaru S, Yamasaki K, Sayama K, Hashimoto K: "So-called biological dressing effects of cultured epidermal sheets are mediated by the production of EGF family, TGF-β and VEGF."The Journal of Dermatological Science. 32. 209-215 (2003)