慢性関節リウマチおよび変形性関節症における新規血管新生関連遺伝子PRG-Bの役割

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15591602
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 森岡 秀夫 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (10230096)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松本 秀男 慶應義塾大学, 医学部, 助教授 (50138038)
• Keywords: plasminogen related gene / synovium / cartilage / rheumatoid arthritis / osteoarthritis / angiogenesis / angiogenesis inhibitor / recombinant protein

Research Abstract

(1)プラスミノーゲン関連遺伝子タイプB(PRG-B) mRNAの慢性関節リウマチ及び変形性関節症関節軟骨・関節滑膜における発現
慢性関節リウマチ及び変形性関節症由来の滑膜細胞・軟骨細胞を材料とし、PRG-B mRNAの発現をRT-PCR法を用いて半定量化し、その発現と各種サイトカインによる遺伝子発現の制御について検討した。(結果)滑膜細胞では、いずれの細胞にもPRG-B mRNAの発現は確認できず、これは各種サイトカイン刺激によってもほぼ同様であった。しかし、軟骨細胞ではPRG-B mRNAの発現が認められ、これはbFGFやIL-1の刺激により増強された。
(2)プラスミノーゲン関連遺伝子タイプBcDNAのクローニング
ヒト胎児肝よりλgt10で作製されたcDNAライブラリー(Takara)より、プラスミノーゲン関連遺伝子タイプBのcDNAをプラスミノーゲンとホモロジーを有するイントロンを用いて、標準的な方法でスクリーニングする。サブクローニングされたcDNAはシークエンシングにより、確認された。
(3)リコンビナントプラスミノーゲン関連遺伝子タイプB由来タンパク質の発現と精製
テンプレートとしてプラスミノーゲン関連遺伝子タイプBcDNAの全長を用いてPCRを行い、pQE-31プラスミドベクターを使用しプラスミノーゲン関連遺伝子タイプBのコンストラクトを作製する。この発現ベクターを導入した大腸菌を宿主発現系とし、Hisタグを用いてNi-NTAカラムにより、目的とするリコンビナントプラスミノーゲン関連遺伝子タイプB由来タンパク質を精製する。精製されたタンパク質はSDS-PAGEにより、確認された。
以上の結果より、現在このリコンビナントタンパクの軟骨細胞・滑膜細胞・血管内皮細胞などに対する生理活性を検討中である。