杯細胞分泌小胞のエクソサイトーシスからみた鼻茸成因のメカニズム

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15591793
• Research Institution: University of Occupational and Environmental Health, Japan
• Principal Investigator: 鈴木 秀明 産業医科大学, 医学部, 教授 (20187751)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宇高 毅 産業医科大学, 医学部, 助手 (10369069) ; 藤村 和伸 産業医科大学, 医学部, 講師 (90299628)
• Keywords: 鼻茸 / 杯細胞 / エクソサイトーシス / 分泌小胞 / Ussing chamber / 共焦点レーザー顕微鏡 / 密着結合 / SDS電気泳動

Research Abstract

1)SDS電気泳動による鼻茸内容液の分析
慢性副鼻腔炎患者から手術時に採取した鼻茸を生理食塩水で洗浄した後、切開して内容液を集めリン酸緩衝液で希釈し、遠心して細胞成分を除去した。遠心上清を12.5%SDSポリアクリルアミド電気泳動にかけその蛋白組成を分析した。しかし蛋白成分が重層ゲルから分離ゲルへ十分に移行せず分析が困難であった。この原因として、プロテオグリカンなどの巨大分子が多量に含まれている可能性が考えられた。
2)鼻茸上皮細胞分泌小胞のエクソサイトーシスの観察
手術時に採取した鼻茸を細胞膜のマーカーであるFM4-64と分泌小胞のマーカーであるlysotracker greenによって生体二重染色した。励起波長は488nmを用い、蛍光波長はFM4-64が650nm、lysotracker greenが540nmである。これを共焦点レーザー走査蛍光顕微鏡下で観察すると、敷石状の上皮細胞頂面が赤色に、これより数μm深層に存在する分泌小胞が緑色に観察された。10μMのATPを加えるとエクソサイトーシスーエンドサイトーシスサイクルにより緑色の部分が赤色に置換されていくのが観察された。分泌が起こっているのが頂面か底側面かを調べるにはZ軸方向の画像再構成が必要であり、現在検討中である。
3)Ussing chamber法による鼻茸上皮イオン輸送の測定
手術時に採取した鼻茸を割断して半球状にトリミングし、これをUssing chamberに取り付けた。電気抵抗は約100Ω・cm^2で、無刺激の状態で約20μA/cm^2の内向き(頂側 基底側)短絡電流(Isc)が検出された。IscはNa^+-channel blockerであるamiloride(10μM)によって抑制され、頂面をATP(10μM)で灌流することによって増加した。ATPによるIscの増加はCl^--channel blockerであるdiphenylamine carboxylate (100μM)の前処置によって抑制された。以上より鼻茸上皮頂面にはATP受容体が存在し、Cl^-分泌を制御していると考えられた。
4)超微形態レベルでの密着結合の観察と細胞膜リン脂質の移動
鼻茸上皮を透過電顕によって観察すると、密着結合の不整な部分が認められた。さらに頂面にビオチン標識したリン脂質を負荷し、底側面への漏逸について現在検討中である。