2003 Fiscal Year Annual Research Report
キメラ分子IgE Fc-IgG FcによるIgE産生抑制効果
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15591803
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| Research Institution | 福井医科大学 |
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Principal Investigator |
山田 武千代 福井大学, 医学部付属病院, 講師 (70283182)
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| Keywords | IgE / クラススイッチ / キメラ蛋白 / GFP発現ベクター / ε germline_transcripts / switch_circle_transcripts / IL-4 / CD40 |
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| Research Abstract |
1)(キメラ蛋白作製)PCRにより、CH1からCH3までのヒトIgG Fc部位のcDNAと、CH2からCH4までのIgE Fc部位のcDNAを得て、ライゲーションしたヒトIgG-IgEのキメラ遺伝子をpAN発現ベクターに組み込んだ。エレクトロポレーションにてSP2/0細胞に遺伝子導入する。この細胞をIMDM液中でFCSを枯渇させながら10日間培養し、Glutamaxで細胞を死滅させ、1〜2Lの上清を得る。抗ヒトIgE抗体カラムによりヒトIgG-IgEのキメラ分子を精製した。
2)(ヒトB細胞のIgEクラススイッチ)ヒトB細胞をIgG-IgEのキメラ分子で前処理し、IL-4及び抗CD40抗体で刺激した。刺激後2日後と4日後にRNAを採取し、ε germline transcripts(εGTs)とswitch circle transcripts(CTs)の発現をそれぞれ検討した。刺激7日後、genomic DNAを用い、digestion-circularization PCR(DC-PCR)にて、IgEクラススイッチを観察した。ヒトB細胞において、IL-4及び抗CD40抗体刺激によるIε-Cμ,Iε-Cε2,Sμ-Sεは、GE2により濃度依存性に抑制された。ヒトB細胞において、IL-4及び抗CD40抗体刺激によるクラススイッチは、GE2により抑制されたが、sCD23にてこの効果は減少し、CD23依存性であることが判明した。
3)(GFP発現ベクターとクラススイッチ)ヒトSμとSγの間にGFPを逆方向に存在させ、Sμ-Sγのrecombinationの際にはSV40 promotor、Sμ-Sγのinversionの際にはCMV promotorが働きGFPが発現するベクターをヒトB細胞株R2G6にエレクトロポレーションにて遺伝子導入した。IgG-IgEのキメラ分子を前処理し、IL-4及び抗CD40抗体で刺激し5日後に、flow cytometlyにてクラススイッチを定量比較した。ヒトB細胞株R2G6を用いた実験でも、GFP陽性細胞数の割合は、5μg/mlのGE2により45%減弱した。
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