2003 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子欠損マウス作成による破骨細胞の転写制御因子OCZFの機能解析
| Project/Area Number |
15591970
|
|---|
| Research Institution | 佐賀医科大学 |
|---|
Principal Investigator |
久木田 明子 佐賀大学, 医学部, 助教授 (30153266)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
久木田 敏夫 九州大学, 大学院・歯学研究院, 助教授 (70150464)
|
|---|
| Keywords | 破骨細胞 / 転写因子 / ノックアウト / ES細胞 |
|---|
| Research Abstract |
OCZF(Osteoclast zinc finger protein)のマウスのホモログであるLRF(Leukocyte-related factor)のゲノムをBACクローンから単離し制限酵素で切断しmapを作成した。と同時に、southern解析を行い制限酵素切断パターンを確認した。さらにこれらの情報をもとに3種のターゲットベクターをデザインし、それぞれのターゲットベクター及びそのコントロールベクターを作成した。それぞれのターゲットベクターについて10個程度のプライマーをデザインし、希釈したコントロールベクターを用いて種々の条件でPCRを行い、fgオーダーでPCRが可能なターゲットベクターを選出した。さらにこのベクターについていくつかのプローブ5'側及び3'側それぞれを作成し、southern解析において使用可能なプローブを選出した。
ES細胞の培養を始める前に7フィーダー細胞をCD-1妊娠マウスの15日の胎児から分離した。フィーダー細胞を増やしマイトマイシンCで2時間半処理したもののうえにES細胞(E14)をまき毎日medium交換を行いながら培養・継代を行い増やした。この細胞にlinealizeしたターゲットベクターを添加後Bio-Rad Gene Pulserを用いて340KV,250μFDの条件で遺伝子導入した。この細胞をgelatinコートしたdich10枚にまき2日後G418を300μg/mlとなるように添加し毎日medium changeをしながら8日培養した。500個コロニーをピックアップしPCRでチェックした結果8個の陽性クローンが得られた。これらのクローンをさらに増やしsouthern解析を行った結果6個のES-LRF(+/-)クローンが得られた。現在これらのクローンを用いてdouble knockout細胞及びノックアウトマウス作成の準備を進めている。
|
Research Products
(4 results)
-
[Publications] M.Rahman: "Two histone deacetylase inhibitors, trichostatin A and sodium butyrate suppress differentiation into osteoclasts but not into machrophage"Blood. 101. 3451-3459 (2003)
-
[Publications] 久木田敏夫: "破骨細胞機能の膜表面受容体を介した制御(特集 骨の細胞と形態機能)"Clinical Calcium. 13. 444-448 (2003)
-
[Publications] T.Kukita: "Extremely high expression of b-actin mRNA in osteoclasts resorbing alveolar bone located at the distal area of the developing molar tooth germ in new born rats"J.Electoron Microse. 52. 545-550 (2003)
-
[Publications] T.Watanabe: "Direct stimulation of osteoclastogenesis by MIP-1a : Evidence obtained from studies using RAW264 cell clone highly responsive to RANKL"J.Endocrinology. 180. 193-201 (2004)
