PTHの骨形成促進作用に及ぼすメカニカルストレスの影響

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15591974
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 荒川 俊哉 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (40306254)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田隈 泰信 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (40095336) ; 羽毛田 慈之 明海大学, 歯学部, 教授 (90164772)
• Keywords: メカニカルストレス / 副甲状腺ホルモン / 骨芽細胞

Research Abstract

副甲状腺ホルモン(PTH)は骨代謝において、骨吸収と骨形成の2面性を示すホルモンである。すなわちPTHを連続的に投与すると骨吸収が誘導され、間欠的に投与すると骨形成が誘導される。しかし、そのメカニズムは明らかになっていない。我々はこれまで、メカニカルストレスをマウス骨細胞から確立されたMLO-Y4A2細胞に負荷すると副甲状腺ホルモン受容体(PTHR)のmRNAが誘導されることを見いだしていた。そこで、メカニカルストレスによるPTHRの発現とシグナル伝達の仕組みを解析するために、PTHRを可視化することを試みた。マウスのPTHR翻訳領域全長を含むcDNAをPCRによってクローニングし、クロンテック社のEGFPベクター(おわんクラゲの蛍光蛋白質GFPを発現するベクター)、pEGFP-N1(N末に融合する蛋白のcDNAを導入)およびpEGFP-C3(C末に融合する蛋白のcDNAを導入)につなぎ込み、PTHRとEGFPの融合蛋白発現ベクターを構築した。この融合蛋白発現ベクターをマウス骨芽細胞株MC3T3-E1細胞にリポフェクション法にて導入し、ネオマイシンによって安定的発現株の分離を試みた結果、強い蛍光が観察される細胞は、付着せず浮遊した状態になった。これはPTHRが多量に発現したために、過剰なシグナルが細胞内に伝達されたため、細胞死を起こしたのではないかと考えられた。更に、ネオマイシンによる選択を行ったところ、蛍光が観察されないが生き残る細胞が得られた。この細胞からtotal RNAを抽出し、RT-PCRによって融合蛋白のmRNAの発現の確認を行ったところ、両ベクターを導入した細胞からmRNAの発現が確認され、融合蛋白を安定的に発現している細胞が得られた。この細胞を使って、メカニカルストレスの影響を検討している。