2003 Fiscal Year Annual Research Report
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15591998
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
柴田 義幸 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助手 (20253685)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
角 美佐 長崎大学, 医学部・歯学部附属病院, 講師 (90284702)
中村 卓 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (30172406)
田代 茂樹 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助手 (20300882)
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| Keywords | FEN-1 / WRN |
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| Research Abstract |
1.FEN-1のWRN結合領域の決定
・WRNのFEN-1結合領域(WRN/FBR)を大腸菌に過剰発現させ、その抽出液よりhis-tagged WRN//FBRをニッケルキレートレジンを用いて精製した。
・^<35>SラベルしたFEN-1全長または各ドメインとhis-tagged WRN/FBRとの結合反応を行い、ニッケルキレートレジンを用いて結合たんぱく質を回収した。
・SDS-PAGEにより結合たんぱく質の分析を行ったところ、FEN-1のC末33アミノ酸残基がWRNとの結合に重要であることが示唆された。
2.In vivoにおけるFEN-1のWRNとの結合の確認
・プラスミドベクターにFEN-1の全長、C末33アミノ酸残基を欠いたもの(FEN-1ΔC)、及びC末33アミノ酸残基(fragC)を挿入し、また同様にWRNのFEN-1結合及び核移行シグナル領域を挿入した。
・上記FEN-1発現及びWRN発現プラスミドを293T細胞に導入し、それら細胞抽出液よりhis-taggedFEN-1及びその結合たんぱく質をニッケルキレートレジンを用いて回収した。
・SDS-PAGEにより結合たんぱく質の分析を行ったところ、in vivoにおけるFEN-1とWRNの有意な結合は検出できなかった。
3.FEN-1の細胞内局在の決定
・pEYFP-C1にFEN-1全長またはfragCを挿入し、これらプラスミドをT24細胞株に導入した。
・レーザー共焦点顕微鏡を用いてその局在を観察したところ、fragC領域に核小体移行シグナルが存在することが示唆された。
4.トランスジェニックマウスの作成
・I型コラーゲンプロモータの下流にmycタグを付けたヌクレアーゼ活性欠損型FEN-1を挿入したプラスミドを構築し、トランスジェニックマウスを作成した。
・現在外来遺伝子を持つものが、オス1匹メス2匹確認できている。
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